王紫馨，萬軍，李怡然，姜瑞文，夏滿瓊，周霞

(西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031)

山楂為薔薇科植物山里紅CrataeguspimiatificiaBge.var. major N, E. Br, 或山楂CrataeguspinnatifidaBge干燥成熟果實(shí)[1]，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂等功效。山楂炮制品主要有凈山楂、焦山楂、山楂炭等[2]。目前，針對(duì)山楂的研究主要是有機(jī)酸、黃酮等成分的含量檢測，以及對(duì)生品的指紋圖譜研究[3]，而對(duì)其炮制品成分整體變化的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬采用HPLC法對(duì)山楂及其炮制品進(jìn)行研究，建立指紋圖譜，旨在較全面反映山楂飲片整體質(zhì)量，區(qū)分山楂飲片及不同炮制品，為山楂飲片質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

安捷倫1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技中國公司)；YP2002型電子天平(常州市衡正電子儀器有限公司)；SB-4200D超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHZ-D3予華牌循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)。

5-羥甲基糠醛(5-HMF)對(duì)照品(批號(hào)：MUST-18031202)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：MUST-18030620)、金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)：MUST-17101605)，純度均在99.00%以上，均購自成都曼思特生物科技有限公司。水為超純水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

共收集山楂飲片11批，見表1。焦品按照《中國藥典》2015年版一部[1]炮制方法制備，炭品按照《中國藥典》2015年版四部炮制通則[4]制炭方法制備，得到11批焦山楂及山楂炭。

表1 不同山楂飲片的采購信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

參考文獻(xiàn)[3,5-6]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用以下色譜條件：Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測波長為325 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；流動(dòng)相為乙腈(A)，0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～10%A；15～30 min，10%～24%A；30～50 min，24%～40%A)。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

稱取5-HMF、綠原酸、金絲桃苷對(duì)照品適量，分別置10 mL容量瓶中，加入甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的配制

精密稱取山楂飲片粉末(過四號(hào)篩)1.0 g，置50 mL錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲處理50 min，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取山楂飲片樣品(批號(hào)S1)1.0 g，按“2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果共有峰保留時(shí)間RSD值均<1.0% ，峰面積RSD值均<1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取山楂飲片樣品(批號(hào)S1)1.0 g，按“2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，分別于0、3、6、12 h按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果共有峰保留時(shí)間RSD值均<1.0%，共有峰峰面積RSD值均<1.0%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)檢測穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取山楂飲片樣品(批號(hào)S1)1.0 g，按“2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果共有峰保留時(shí)間RSD值均<1.0%，共有峰峰面積的RSD值均<1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 樣品指紋圖譜的建立

稱取11批山楂生品、焦品及炭品，按“2.3”項(xiàng)方法制成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測定，色譜圖見圖1-3?？梢姡谏介珗D譜中共標(biāo)示出14個(gè)特征峰；在焦山楂圖譜中共標(biāo)示出12個(gè)特征峰，與生山楂相比，其中包含10個(gè)共有峰及炮制后生成的2個(gè)新特征峰(峰1、峰16)；在山楂炭圖譜中共標(biāo)示出10個(gè)特征峰，與生山楂相比，其中包括8個(gè)共有峰及炒炭后生成的2個(gè)新特征峰(峰1、峰16)。經(jīng)與對(duì)照品確認(rèn)，山楂飲片指紋圖譜中共歸屬2個(gè)特征峰，分別為綠原酸和金絲桃苷；焦山楂、山楂炭指紋圖譜中共歸屬3個(gè)特征峰，分別為5-HMF、綠原酸、金絲桃苷，見圖4。

84.6263.4742.3121.160.00mAUS11S114.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/min

14.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/minS11S1161.24121.1080.9740.830.70mAU

14.4921.7428.9936.2343.4850.730.007.25t/minS11S1179.97120.0260.470.92mAU

2.6 生山楂、焦山楂及山楂炭飲片指紋圖譜的比較

通過對(duì)比山楂及炮制品的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，14個(gè)峰均有一定變化。對(duì)比生山楂和焦山楂飲片指紋圖譜，其中有10個(gè)共有峰和2個(gè)新生成的峰，峰4、峰7、峰8、峰14幾乎消失，新生成峰1、峰16。對(duì)比生山楂和山楂炭飲片指紋圖譜，在生山楂飲片中峰面積相對(duì)較高的峰5、峰12、峰13在炒炭后峰面積分別降低了2、7、6倍，4號(hào)、7～9號(hào)、11號(hào)、14號(hào)色譜峰面積大幅度下降。山楂和山楂炭飲片指紋圖譜中有8個(gè)共有峰及2個(gè)新生成的峰，其中除峰10外，差異極為顯著，新生成峰1、峰16。炒炭前后色譜峰數(shù)目、峰面積均發(fā)生顯著變化。

ABCR

山楂炭與山楂飲片歸屬的特征峰相比，在山楂炭指紋圖譜中峰3(5-HMF)的峰面積相對(duì)較高。峰3、峰5、峰12在炒炭前后含量變化幅度極為顯著，由此推斷山楂炒炭后機(jī)理變化與這三種成分有密切關(guān)系。山楂飲片經(jīng)炮制后，生成新物質(zhì)5-MHF，但隨炮制程度逐漸分解，含量下降。綠原酸、金絲桃苷含量隨炮制程度逐漸下降，見表2。

表2 山楂炮制前后特征峰峰面積變化

2.7 相似度評(píng)價(jià)

采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2012.130723版軟件，以S1的圖譜為參照，采用平均數(shù)法分別生成11批山楂飲片擬合圖譜(圖4)，以擬合圖譜為對(duì)照分析11批山楂生品及炮制品飲片樣品相似度，結(jié)果見表3。可見，不同批次的山楂飲片指紋圖譜相似度均較高(大于0.9)，說明市場上銷售的山楂質(zhì)量較穩(wěn)定。

表3 11批山楂飲片及其炮制品的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本文考察了多種提取溶劑、提取次數(shù)(超聲次數(shù))、提取時(shí)間[6-7]的提取效果，結(jié)果顯示提取方法為甲醇超聲提取50 min時(shí)，各色譜峰穩(wěn)定且峰形較好，所以選擇甲醇為提取溶劑。同時(shí)考察了流動(dòng)相、柱溫，發(fā)現(xiàn)采用0.1%乙酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相，各色譜峰得到較好的分離，柱溫30 ℃特征峰分離度較好。

考察了238、254、265、295、305、325、355、390 nm 8個(gè)波長下的色譜圖[3,5]，結(jié)果顯示325 nm波長下山楂的圖譜信息量大，色譜峰多，基線平穩(wěn)，分離度及峰形均較好，故選擇325 nm作為檢測波長。

3.2 指標(biāo)成分的選擇

根據(jù) 11批山楂飲片及其炮制品HPLC圖譜分析，發(fā)現(xiàn)生品與焦品、炭品均有8個(gè)共有峰。在分析生品以及炮制品的共有峰時(shí)，選擇了響應(yīng)值最高的5號(hào)峰(綠原酸)作為參照峰(S)，計(jì)算各共有峰的峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果顯示共有峰保留時(shí)間的RSD小于 1%，由圖4可見各共有峰面積相差較大，表明各飲片成分相似，但共有成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定差異。

綠原酸(有機(jī)酸類)、金絲桃苷(黃酮類)均為山楂生品中有效活性成分[8,13-15]，綠原酸有抗氧化、保護(hù)心血管等作用，金絲桃苷具有抗感染、對(duì)心、腦血管的保護(hù)作用等多種生理活性，而5-HMF為炮制品中主要活性成分，可能具有凝血作用[9-12]，以上3種成分在設(shè)立的指紋圖譜中都有較清晰的顯示，可作為指標(biāo)性成分。

3.3 共有峰與相似度評(píng)價(jià)

本研究采用HPLC法建立了山楂不同炮制品的指紋圖譜，分別以山楂及炮制品的有效成分5-HMF、綠原酸、金絲桃苷為指標(biāo)性成分，確立了8個(gè)共有峰。山楂相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，11批供試品的 HPLC指紋圖譜相似度高，相似度大于0.9，符合中藥指紋圖譜的技術(shù)要求，各個(gè)共有峰出峰時(shí)間相對(duì)平穩(wěn)，峰形理想，可將此作為控制山楂質(zhì)量的依據(jù)之一。除指標(biāo)成分外，還發(fā)現(xiàn)其他色譜峰面積也有改變，后續(xù)可對(duì)其成分開展進(jìn)一步研究。