柯培雄，張許，岑怡，張貴平，張根水

(廣州醫(yī)科大學藥理學系，廣東 廣州 511436)

糖尿病是一種以糖代謝紊亂為主要特征的內(nèi)分泌代謝綜合疾病，是胰島素相對或絕對不足，或利用缺陷而引起的，表現(xiàn)為高血糖和糖尿，多伴有眼、腎、神經(jīng)、皮膚、血管和心臟等組織、器官的慢性并發(fā)癥[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種區(qū)別于高血壓、冠狀動脈疾病和其他心血管疾病的特殊心肌病，其病理組織表現(xiàn)為心肌細胞的肥大凋亡及心肌間質(zhì)纖維化[2]，心功能改變主要表現(xiàn)為舒張功能不全而收縮功能受損不明顯，心室壁彈性減弱[3]。

和厚樸酚(Honokiol,HKL)是從中藥厚樸中提取的主要活性成分之一，是厚樸酚的同分異構體[4]，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、中樞性肌肉松弛和神經(jīng)抑制作用、抗病原微生物、降低膽固醇等藥理作用[5]。和厚樸酚具有降低2型糖尿病小鼠血糖值并改善血脂紊亂導致的胰島素抵抗作用[6]。心血管藥理研究提示和厚樸酚具有明顯改善自發(fā)性高血壓大鼠心血管功能[7]，并在成年大鼠心肌細胞實驗上證實其具有抑制心肌細胞收縮及降低心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度作用[8]。目前和厚樸酚對DCM的作用及其機制鮮有報道，本實驗采用SD大鼠離體心肌成纖維細胞培養(yǎng)技術與糖尿病HFpEF小鼠模型研究和厚樸酚對心肌纖維化與心功能作用的影響，為DCM的預防治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及試劑

和厚樸酚(HPLC>98%，Aladdin，H111272)；低糖及高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、II型膠原酶、DMSO(Gibco公司)；PMSF細胞蛋白酶抑制劑(凱基生物)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；4%多聚甲醛(捷威斯生物科技有限公司)；PBS緩沖液(賽維爾生物科技有限公司)；20×ECL發(fā)光液(Cell signal公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術有限公司)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)；兔抗大鼠FN抗體(Boster公司)；兔抗大鼠Collagen I抗體、兔抗大鼠Collagen Ⅲ 抗體(Bioworld公司)；兔抗大鼠CTGF抗體(Affinity公司)；兔抗大鼠TGF-β抗體、兔抗大鼠GSK-3β抗體、兔抗大鼠β-catenin抗體(Abcam公司)；山羊抗兔IgG/HRP標記抗體(Cell signal公司)；其他化學試劑(廣州化學試劑廠)。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱HF90(Heal Force)；5810R低溫高速離心機(Hettich)；H1010420電熱恒溫水浴鍋(上海精宏)； WIX-EP300垂直電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(BioRad)；Epoch酶標儀(BeckMan)；OPTIMAX自動洗片機(Kodak)；ChemiDox XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP)；Eclipse Ni-U正置顯微鏡(Nikon)；Vevo-2100彩色超聲成像系統(tǒng)(Visual Sonics)。

1.3 實驗動物

SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量(200±5)g，SPF級，雄性，由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002。C57BL/6小鼠，6周齡，體質(zhì)量(20±2)g，SPF級，雄性，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0034。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)、分組與給藥

將成年SD大鼠斷頸處死，沿劍突正中線左側(cè)進行開胸操作，無菌條件下取出心臟，放入裝有4 ℃、0.01 mmol/L預冷PBS的培養(yǎng)皿中，剪掉心房及結(jié)締組織等，PBS反復沖洗，心臟剪成1 mm3大小組織塊。將組織碎塊置入無菌離心管中，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，反復吹打混勻，均置于37 ℃、200 r/min搖床上消化60 min。消化結(jié)束后加入等體積10% FBS/DMEM進行終止，1 000 r/min離心5 min，棄上清。重復3次，加入10% FBS/DMEM反復吹打混勻移入培養(yǎng)皿中，放入37 ℃、5%(φ) CO2培養(yǎng)箱中，差速貼壁60～90 min，貼壁的細胞為心肌成纖維細胞，將未貼壁的心肌細胞等棄掉，重新加入10% FBS/DMEM，每隔1天換液1次。

2.1.1 HKL對高糖誘導心肌纖維化的影響 將細胞實驗分為6組，即正常對照組：10% FBS的低糖DMEM；高糖模型組：10% FBS的高糖DMEM；低劑量HKL組，加入0.1 μmol/L的HKL溶液；中劑量HKL組，加入0.3 μmol/L的HKL溶液；高劑量HKL組，加入1 μmol/L的HKL溶液；溶劑對照組：加入DMSO(<0.1%)。

2.1.2 HKL對GSK-3β誘導心肌纖維化的影響 將細胞實驗分為4組，即高糖模型組：10% FBS的高糖DMEM；GSK-3β組：加入100 nmol/L GSK-3β；HKL加GSK-3β組，先加入100 nmol/L GSK-3β孵育1 h，再加入1 μmol/L的HKL溶液；溶劑對照組：加入DMSO(<0.1%)。

2.1.3 HKL對GSK-3β表達的影響 將細胞實驗分為3組，即高糖模型組：10% FBS的高糖DMEM；HKL組：加入1 μmol/L的HKL溶液；溶劑對照組：加入DMSO(<0.1%)。

細胞給藥后培養(yǎng)12 h后，采用Western blot法檢測CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β、CTGF、FN、GSK-3β和β-catenin的表達水平。

2.2 1型糖尿病模型制備與分組

根據(jù)前期的研究[9]，將C57小鼠連續(xù)6 d腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)60 mg/(kg·d)，正常對照組給予等量檸檬酸緩沖液。STZ注射結(jié)束之后第4天測小鼠隨機血糖，連續(xù)測量3 d，小鼠血糖>16.7 mmol/L認為是糖尿病小鼠，每隔1周測量小鼠隨機血糖。

根據(jù)實驗設計將C57小鼠分為3組，每組5只，分別為：正常對照組、糖尿病模型組、HKL組。小鼠成模后第8周開始給藥25 mg/(kg·d)，給藥組連續(xù)腹腔注射給藥4周，正常對照組和糖尿病模型組給予等劑量生理鹽水。采用M 型超聲心動圖測量左室收縮與舒張功能：心律(HR)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWd)、左室后壁收縮末期厚度(LVPWs)、左室射血分數(shù)(EF)、左室收縮百分率(FS)、左室舒張早期E峰最大流速(E)、左室舒張晚期A峰最大流速(A)、舒張早期E峰下降時長(MVDT)、等容舒張時長(IVRT)，計算E/A比值。所有數(shù)值均通過連續(xù)5個心動周期計算獲得。

2.3 心肌組織病理學檢測

心臟組織經(jīng)4%(φ)多聚甲醛固定后制作石蠟切片后進行HE染色(烤片-二甲苯脫蠟水化-蘇木素染色-酸性乙醇溶液分化-乙醇脫水透明-中性樹膠封片)和Masson三色染色(烤片-二甲苯脫蠟水化-蘇木素染色-酸性乙醇溶液分化-麗春紅品紅染液染色-磷鉬酸水溶液分化-苯胺藍染色-乙醇脫水透明-中性樹膠封片)，最后在正置顯微鏡下觀察心肌組織變化及纖維化程度。

2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度HKL對心肌纖維化的影響

Western blot結(jié)果表明(圖1)，與正常對照組相比，高糖培養(yǎng)能明顯促進心肌纖維化相關蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β、CTGF和FN的表達(P<0.05)；0.1、0.3、1 μmol/L的HKL組可以明顯抑制高糖誘導的心肌纖維化相關蛋白表達(P<0.05)；高劑量HKL組較低劑量HKL組降低心肌纖維化相關蛋白表達的效果更為明顯；DMSO對心肌纖維化相關蛋白的表達無明顯影響(P>0.05)。

CollagenⅠCollagenⅢTGF-βGTGFFNβ-actinCollagenⅠ/β-actin2.01.51.00.50.00.80.60.40.20.0###*123456123456123456CollagenⅢ/β-actin###*###*###*###*0.60.40.20.0TGF-β1/β-actin2.01.51.00.50.0CTGF/β-actin2.52.01.51.00.50.0FN/β-actin123456123456123456

3.2 HKL對GSK-3β 誘導心肌纖維化的影響

Western blot結(jié)果表明(圖2)，與高糖模型組相比，GSK-3β能明顯促進心肌纖維化相關蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β、CTGF和FN的表達(P<0.05)，并且促進β-catenin的表達(P<0.05)；HKL加GSK-3β組可以明顯抑制GSK-3β誘導的心肌纖維化相關蛋白表達(P<0.05)，并且抑制β-catenin的表達(P<0.05)；DMSO對心肌纖維化相關蛋白和β-catenin的表達無明顯影響(P>0.05)。

CollagenⅠCollagenⅢTGF-βCTGFFNβ-actinCollagenⅠ/βactin1.51.00.50.0#*#*#*#*#*#*2.01.51.00.50.0CollagenⅢ/β-actin123412341234123412342.01.51.00.50.02.52.01.51.00.50.0TGF-β1/β-actinCTGF-/β-actinFN/β-actin3210β-cateninβ-actin3210β-catenin/β-actin1.HG；2.100nmol/LGSK-3β；3.100nmol/LGSK-3β+1μmol/LHKL；4.DMSO。與高糖模型組相比：*P<0.05；與100nmol/LGSK-3β組相比：#P<0.05。圖2HKL對GSK-3β誘導心肌纖維化的影響(n=5)Figure2EffectofHKLontheexpressionofmyocardialfibrosis-relatedproteinsinducedbyGSK-3β(n=5)1234

3.3 HKL對GSK-3β表達的影響

Western blot結(jié)果表明(圖3)，與高糖模型組相比，HKL能明顯降低β-catenin的表達(P<0.05)，DMSO對β-catenin的表達無明顯影響(P>0.05)。

3.4 HKL對糖尿病HFpEF小鼠心功能的影響

超聲結(jié)果表明(圖4、圖5)，與高糖模型組相比，HKL對收縮功能指標HR、LVIDd、LVIDs、LVPWd、LVPWs、EF、FS無顯著性影響(P>0.05)；明顯改善模型小鼠出現(xiàn)舒張功能障礙的典型特征，即E/A比值下降，MVDT和IVRT延長(P<0.05)。

3.5 HKL對糖尿病小鼠心肌結(jié)構和心肌間質(zhì)膠原沉積的影響

染色結(jié)果表明(圖6)，與正常對照組相比，高糖模型組HE染色顯示明顯的心肌結(jié)構異常，心肌纖維斷裂，細胞結(jié)構紊亂，細胞間隙增大，Masson染色觀察到心肌間質(zhì)膠原沉積增加。與高糖模型組相比，HKL組HE染色顯示心肌結(jié)構明顯改善，心肌纖維斷裂減少，細胞結(jié)構正常，細胞間隙減小，Masson染色觀察到心肌間質(zhì)膠原沉積減少。

GSK-3ββ-actinGSK-3β/β-actin1.51.00.50.0123*

1. Control； 2. DM； 3. HKL。

123#*#*#*2.52.01.51.00.50.0IVRT/msMVDT/ms123123123403020100403020100E/ARatio

4 討論

心肌纖維化的病理特征為心肌間質(zhì)成纖維細胞異常增殖，細胞外基質(zhì)沉積異常增加，心室壁順應性下降，最終導致心臟收縮與舒張功能異常。引起心肌纖維化的因素有很多，而GSK-3β是其重要因素之一。Wang等[10]通過構建心臟敲除GSK-3β小鼠模型證明GSK-3β的失活能抑制糖尿病心肌纖維化，同時給野生糖尿病小鼠使用GSK-3β特異性抑制劑后發(fā)現(xiàn)心臟纖維化被完全抑制。β-catenin是Wnt信號轉(zhuǎn)導通路的下游元件，激活Wnt信號使細胞內(nèi)游離β-catenin的水平上升。Wnt信號傳導使GSK-3β被抑制，β-catenin不能被正常水解而積累，過量的β-catenin進入細胞核與目的基因結(jié)合，促進細胞增殖[11]。Hahn等[12]研究表明，β-catenin過表達可刺激新生大鼠心肌成纖維細胞的增殖、分化，誘導心肌細胞肥大。心臟Wnt/β-catenin信號通路增強是糖尿病心肌病HFpEF重要特征。β-catenin與GSK-3β之間存在著密切聯(lián)系，兩者之間相互作用可能受到HKL的調(diào)控。實驗結(jié)果表明HKL能顯著降低GSK-3β誘導的纖維化相關蛋白CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β、CTGF和FN的表達水平并顯著降低GSK-3β和β-catenin的表達水平，說明HKL通過下調(diào)GSK-3β和β-catenin抑制纖維化。

實驗利用腹腔注射STZ建立糖尿病HFpEF模型。有研究表明，1型糖尿病患者心臟舒張功能障礙比收縮功能障礙更為常見[13]，存在舒張早期充盈減少，心房充盈增加，等容舒張時間及減速時間延長[14]。

1. Control; 2. DM; 3. HKL。圖6 HKL對糖尿病小鼠心肌結(jié)構的影響(400×,比例尺:50 μm)Figure 6 Effect of HKL on the myocardial structure of diabetic mice (400×,scale bar:50 μm)

本實驗結(jié)果表明HKL對糖尿病小鼠左室收縮功能無顯著性影響，但是對舒張功能影響顯著，即E/A比值下降，MVDT與IVRT明顯延長。此外，HKL可明顯改善糖尿病心肌結(jié)構損傷和膠原沉積，對心肌細胞有一定的保護作用。

本研究結(jié)果表明，HKL 可通過下調(diào)GSK-3β和β-catenin抑制纖維化，從而改善糖尿病心肌結(jié)構與舒張功能，防止糖尿病心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展。已知GSK-3β介導纖維化作用還與TGF-β1/Smad-3信號通路有關。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)可以促進心肌成纖維細胞TGF-β的表達。利用GSK-3β作為纖維化誘導劑，也可以促進高糖模型中心肌成纖維細胞TGF-β的表達，說明TGF-β信號通路參與了GSK-3β誘導心肌纖維化的作用。在糖尿病誘導的心肌纖維化中，β-catenin、GSK-3β、TGF-β之間存在著密切聯(lián)系，涉及GSK-3β、β-catenin、TGF-β1/Smad-3的信號網(wǎng)絡已成為心肌纖維化的一個強有力的調(diào)節(jié)因子。然而，該信號網(wǎng)絡的具體機制尚不清楚，需要進一步研究。