冀宇蘭 ，郭博文 ，苗俊秋 ，原紅霞 ，李青山

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西晉中030619；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點實驗室，山西晉中030619）

●“實驗”雖然是現(xiàn)代科學(xué)研究常用的方法，然在我國卻自古有之。古代學(xué)者王沖說“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實驗也”，顏之推說“昔在江南，不信有千 人帳，及來河北，不信有二萬斛船，皆實驗也”，大凡此義均與現(xiàn)代科學(xué)意義上的experiment相通。照此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)并非只是經(jīng)驗之學(xué)，而更充滿實驗的思想和方法。實驗中醫(yī)藥學(xué)，將現(xiàn)代實驗科學(xué)的方法和傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)的實驗方法融合起來，開拓現(xiàn)代實驗生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的新領(lǐng)域。

心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是誘發(fā)心血管疾病如心力衰竭、缺血再灌注損傷等的重要因素［4］。

復(fù)方當(dāng)歸注射液是由當(dāng)歸、川芎和紅花制成的常用中藥復(fù)方制劑，其功效為活血通經(jīng)、祛瘀止痛［5］，臨床上常用于心腦血管缺血性疾病的治療［6］?，F(xiàn)代藥理學(xué)實驗表明，復(fù)方當(dāng)歸注射液具有改善大鼠腦缺血、心肌缺血等作用［7］，目前針對復(fù)方當(dāng)歸注射液的臨床研究和藥理研究報道較多，但其作用機(jī)制報道較少。因此，本研究從抗氧化應(yīng)激的角度，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）清除法及羥基自由基清除法測定復(fù)方當(dāng)歸注射液的抗氧化活性，在此基礎(chǔ)上以對叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（EA.hy926）氧化應(yīng)激損傷建立體外模型，進(jìn)一步研究復(fù)方當(dāng)歸注射液在細(xì)胞水平的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 EA.hy926 人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；復(fù)方當(dāng)歸注射液購自上海新亞藥業(yè)高郵有限公司，批號：180605-2）。高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液均購自武漢博士德生物工程有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原性谷胱甘肽（GSH-Px）試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所，噻唑藍(lán)、二甲基亞砜（DMSO）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器 生物安全柜（ESCO，型號AC2-4S1）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（ESCO，型號CCL-170B-8）；倒置光學(xué)顯微鏡（麥克奧迪）；連續(xù)波長多功能化學(xué)發(fā)光熒光酶標(biāo)儀（Molecular devices）；臺式高速冷凍離心機(jī)（Genespeed）；-80 ℃超低溫冰箱（ESCO，型號 UUS-714A-1-5D-SS）；微量加樣器（Eppendorf）；96 孔板混勻儀（WIGGENS）。

1.2 實驗方法

1.2.1 復(fù)方當(dāng)歸注射液DPPH 自由基清除率測定 參照 Siow HL 等［8］方法測定 DPPH 自由基清除率。具體步驟如下：取2 mL DPPH 溶液（濃度約為0.05 mg/mL），與不同濃度復(fù)方當(dāng)歸注射液2 mL，充分混勻，暗處反應(yīng)30 min，517 nm 處測量其吸光度值A(chǔ)sample，控制樣本用2 mL 蒸餾水代替提取物，進(jìn)行相同的處理后，于517 nm 處測定吸光度，結(jié)果記為Acontrol。BHT 為陽性對照。按公式（Acontrol-Asample）/Acontrol×100%，計算復(fù)方當(dāng)歸注射液的DPPH 自由基清除率（%）。

1.2.2 復(fù)方當(dāng)歸注射液羥基自由基清除率測定 參照惠和平等［9］方法稍做修改測定羥基自由基清除率。具體步驟如下：在反應(yīng)體系中分別加入0.2 mL 7.5 mmol/L 鄰二氮菲、2 mL PBS 溶液（0.15 mol/L，pH 7.5）、0.2 mL 7.5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和 3.8 mL蒸餾水，加入待測樣品0.4 mL 混勻后，加入0.4 mL體積分?jǐn)?shù)1 %雙氧水溶液搖勻，37 ℃條件下水浴60 min，在 510 nm 處測其吸光度（A 樣）；另設(shè)陰性對照管和正常管，陰性對照管不加待測樣品（用0.4 mL 蒸餾水代替樣品液），重復(fù)上述操作，在510 nm 處測其吸光度（A 損）；正常管不加待測樣品和雙氧水溶液（用0.8 mL 蒸餾水代替），重復(fù)上述操作，在510 nm 處測其吸光度（A 空）。按公式（A 樣-A 損）/（A 空-A 損）×100%，計算復(fù)方當(dāng)歸注射液羥基自由基清除率（%）。

1.2.3 復(fù)方當(dāng)歸注射液對EA.hy926 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用

1.2.3.1 EA.hy926 細(xì)胞培養(yǎng) EA.hy926 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10 %（V/V）胎牛血清和1 %青鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞達(dá)到80%左右的融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.3.2 MTT 法檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長期的EA.hy926 細(xì)胞，以每毫升 1.0×105個接種于 96 孔板，每孔100 μL。將培養(yǎng)板放入孵箱中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下正常培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，以不同濃度（5，10，20 μL/mL）的復(fù)方當(dāng)歸注射液分別孵育6 h，12 h 和24 h，棄去培養(yǎng)液，再以600 μmol/L 的t-BHP 繼續(xù)處理3 h。以含1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基為正常組，每組各5 個平行。每孔加入 MTT（5 mg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，小心吸取上清液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶解結(jié)晶顆粒，波長490 nm 處測定光密度值。

1.2.3.3 LDH 活力、MDA 含量及 GSH-Px、SOD 活性檢測 EA.hy926 細(xì)胞經(jīng)不同濃度（5，10，20 μL/mL）復(fù)方當(dāng)歸注射液預(yù)處理，棄去培養(yǎng)液，再以600 μmol/L t-BHP 作用 3 h 后，0.25 %胰酶消化，冷PBS 清洗兩次，然后采用細(xì)胞裂解緩沖液進(jìn)行細(xì)胞裂解，10 000 r/min、4 ℃離心 10 min，取上清，分別按 LDH、MDA、GSH-Px 和 SOD 試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方當(dāng)歸注射液清除DPPH 自由基的能力

不同濃度的復(fù)方當(dāng)歸注射液DPPH 自由基清除活性如圖1A 所示，結(jié)果表明復(fù)方當(dāng)歸注射液對DPPH 自由基具有清除作用，且具有量效關(guān)系。應(yīng)用GraphPad Prism 7.04 軟件處理復(fù)方當(dāng)歸注射液的量-效關(guān)系數(shù)據(jù)并計算其清除DPPH 自由基的 EC50值為 20.88 μL/mL。

2.2 復(fù)方當(dāng)歸注射液清除羥基自由基的能力

不同濃度的復(fù)方當(dāng)歸注射液羥基自由基清除活性如圖1B 所示，結(jié)果表明復(fù)方當(dāng)歸注射液對羥基自由基的清除活性隨濃度升高而增大，呈現(xiàn)濃度依賴性。應(yīng)用GraphPad Prism 7.04 軟件處理復(fù)方當(dāng)歸注射液的量-效關(guān)系數(shù)據(jù)并計算其清除羥基自由基的EC50值為0.8211 mL/mL。

圖1 復(fù)方當(dāng)歸注射液對DPPH 自由基、羥基自由基清除率的影響

圖2 復(fù)方當(dāng)歸注射液對t-BHP 誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞存活率影響

2.3 復(fù)方當(dāng)歸注射液對EA.hy926 細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用

2.3.1 復(fù)方當(dāng)歸注射液對t-BHP 損傷的EA.hy926 細(xì)胞活性的影響 與正常細(xì)胞組相比，6 h，12 h 和24 h 3 個時間段模型組（t-BHP 損傷組）細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組（t-BHP 損傷組）相比，復(fù)方當(dāng)歸注射液組細(xì)胞活力隨濃度梯度增高逐漸上升（P＜0.05，P＜0.01），呈現(xiàn)了明確的量效關(guān)系。結(jié)果見圖2。

2.3.2 復(fù)方當(dāng)歸注射液對細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px 的活力及MDA、LDH 含量的影響 與正常細(xì)胞組相比，模型組（t-BHP 損傷組）SOD、GSH-Px活力明顯下降（P＜0.01），MDA、LDH 含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組（t-BHP 損傷組）相比，復(fù)方當(dāng)歸注射液組SOD、GSH-Px 活力顯著升高（P＜0.01），MDA、LDH 含量顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 復(fù)方當(dāng)歸注射液對t-BHP 誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞SOD、GSH-Px 的活力及 MDA、LDH 含量的影響

3 討 論

近年來大量研究表明生物體內(nèi)過量的氧自由基及氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)心力衰竭、缺血再灌注損傷的重要原因之一［10］。復(fù)方當(dāng)歸注射液作為當(dāng)歸、川芎、紅花為組分制成的中藥復(fù)方注射液，臨床上常用于心腦血管缺血性疾病的防治［6］，為闡明臨床上復(fù)方當(dāng)歸注射液的作用機(jī)制，本研究以DPPH 自由基及羥基自由基清除法并進(jìn)一步在細(xì)胞水平建立氧化應(yīng)激損傷模型來系統(tǒng)研究復(fù)方當(dāng)歸注射液的體外抗氧化性能。

DPPH 自由基是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其可以捕獲其他的自由基［11］，對 DPPH 自由基的清除效果可以反映物質(zhì)的抗氧化能力。OH自由基能與絕大部分生物大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，其反應(yīng)可能導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷或細(xì)胞死亡［12］。因此，及時清除多余的OH 自由基對保護(hù)機(jī)體的正常生命活動和生理代謝反應(yīng)具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方當(dāng)歸注射液能有效地清除DPPH 自由基和羥基自由基，具有一定的體外抗氧化活性。

自由基激發(fā)的脂質(zhì)過氧化物可以導(dǎo)致質(zhì)膜損傷，當(dāng)細(xì)胞破壞或細(xì)胞膜通透性增加時，LDH 從細(xì)胞內(nèi)漏出，因此，LDH 水平可較準(zhǔn)確反映細(xì)胞或細(xì)胞膜損傷的程度［13］。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其水平的高低可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度，細(xì)胞內(nèi)MDA 含量可提示氧化應(yīng)激損傷程度［14］。本研究中，模型組LDH 和MDA 升高，而不同濃度的給藥組LDH 和MDA 含量隨復(fù)方當(dāng)歸注射液劑量的增加逐漸下降，表明復(fù)方當(dāng)歸注射液可以維持EA.hy926 細(xì)胞的完整性。SOD 是一種重要的抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活性高低間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力［15］。GSH-Px 作為抗氧化酶能夠拮抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，修復(fù)受損細(xì)胞，其活性可以反映機(jī)體的抗氧化能力。本研究中，模型組SOD 和GSH-Px 下降，而不同濃度給藥組中SOD 和GSHPx 隨復(fù)方當(dāng)歸注射液劑量的增加則逐漸升高，表明復(fù)方當(dāng)歸注射液具有潛在的抗氧化作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明復(fù)方當(dāng)歸注射液對DPPH 自由基和OH 自由基均有較明顯的清除作用，對t-BHP 誘導(dǎo)EA.hy926 細(xì)胞氧化損傷有一定的保護(hù)作用，提示復(fù)方當(dāng)歸注射液的藥理作用機(jī)制可能與其抗氧化作用密切相關(guān)。