李 娟 ，張 璇 ，陳彤垚 ，王倩玉 ，3，杜晨暉 ，秦雪梅 ，張福生 ，馬存根

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，山西太原030031； 2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西太原030006；3.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原030006； 4.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

遠(yuǎn)志，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，是我國重要的大宗中藥材之一。遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd. 或卵葉遠(yuǎn)志Polygala sibirica L.的干燥根，在我國應(yīng)用歷史悠久，其性味苦、辛、溫，歸心、腎、脾經(jīng)，具有安神益智［1］、祛痰［2］、消腫等功效，常用于治療失眠多夢、健忘驚悸、神志恍惚、咳痰不爽、瘡瘍腫毒、乳房腫痛等［3］。目前，遠(yuǎn)志屬其他藥用植物在全國不同地區(qū)應(yīng)用廣泛，如長毛籽遠(yuǎn)志（P.wattersii Hance.）、華南遠(yuǎn)志（P.glomerata Lour.）、香港遠(yuǎn)志（P.hongkongensis Hemsl.）等均具有活血、化瘀作用［4-8］。但有關(guān)遠(yuǎn)志發(fā)揮抗凝血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚為空白，罕見報道。

本研究采用回流提取和溶劑萃取法得到遠(yuǎn)志不同極性部位，使用經(jīng)典的毛細(xì)管法測定小鼠凝血時間，篩選并比較了遠(yuǎn)志抗凝血作用的有效部位。并采用高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析對上述提取、分離的各部位進行了化學(xué)成分差異研究，探討了中藥材遠(yuǎn)志發(fā)揮抗凝血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為開發(fā)遠(yuǎn)志新的臨床用途提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥材

1.1.1 實驗動物 品系：SD 小鼠；性別：雄性；體質(zhì)量：18~22 g；來源：北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK2011-0012，飼養(yǎng)：清潔級動物房常規(guī)飼養(yǎng)。置于自然晝夜節(jié)律光照條件下，自由進食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。

1.1.2 實驗藥物 遠(yuǎn)志筒藥材（Polygala tenuifolia）購買于河北安國藥材市場，樣品經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心張福生副教授鑒定為正品。阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號20130078）。

1.1.3 試劑與儀器 Polygalaxanthone Ⅲ（MUST-14100905，純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司）；3，6′-disinapoyl sucrose（16011921，純度為98%成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；95%乙醇（分析純），石油醚（分析純），乙酸乙酯（分析純），正丁醇（分析純），以上試劑均為北京化工廠生產(chǎn)。

Waters e2695 高效液相色譜儀（配自動進樣器、四元梯度泵、柱溫箱、UV 檢測器；色譜柱為Venusil Agela MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。GCMS 聯(lián)用儀（Agilent 5977 B 氣質(zhì)聯(lián)用儀，G4513A自動進樣器，四級桿質(zhì)量分析器）；HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A）上海亞榮生化儀器廠，正空干燥箱（DZF-1B）上海躍進醫(yī)療機器廠，調(diào)溫電熱套（ZDHW）北京市光明醫(yī)療儀器廠，超聲波清洗器（KQ5200E）昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 遠(yuǎn)志藥材傳統(tǒng)水提取物的制備 稱取30 g遠(yuǎn)志藥材（剪短至1~2 cm），置500 mL 的圓底燒瓶中，加入10 倍量蒸餾水（300 mL），加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，用抽濾瓶抽濾，濾液濃縮至一定體積，得水提物。

1.2.2 遠(yuǎn)志藥材不同極性部位的制備 稱取250 g遠(yuǎn)志藥材（剪短至1~2 cm），加10 倍量80%乙醇（2500 mL）浸泡過夜，加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，用抽濾瓶抽濾，濾液減壓回收至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對濾液各萃取3 次，回收溶劑，濃縮至浸膏，60 ℃真空干燥，分別得石油醚部位（部位A）、乙酸乙酯部位（部位B）、正丁醇部位（部位 C）、萃取水部位（部位 D）［9］，結(jié)果見圖1。部位A、B、C、D 分別溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，分別配制成濃度為0.013 15 g/mL、0.007 13 g/mL、0.056 21 g/mL、0.044 47 g/mL 的溶液。

圖1 遠(yuǎn)志不同極性部位的制備流程圖

阿司匹林溶液（陽性對照）：使用時取阿司匹林片適量，用研缽磨成粉末，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液適量，配制成濃度為1.271 mg/mL的溶液。

1.2.3 分組與給藥 取小鼠70 只，隨機分為7組，每組10 只。隨機分為空白組（0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液）、阿司匹林對照組、A 組、B 組、C 組、D組、E 組（水提物對照組），灌胃給藥體積0.1 mL/10 g，遠(yuǎn)志成人臨床用藥劑量為3~10 g/60 kg，各部位所配劑量為人用最大劑量的 30 倍，即 5 g/kg［9］。

1.2.4 小鼠凝血時間的測定 對小鼠連續(xù)給藥8 d，于末次給藥 1 h 后，用長 7～10 cm、內(nèi)徑 1 mm 的玻璃毛細(xì)管（上海新朋玻璃儀器有限公司，規(guī)格：0.9~1.1 mm，長度：10 cm，數(shù)量：500 根）插入小鼠眼內(nèi)眥后靜脈叢中，深約4～5 mm，輕輕轉(zhuǎn)動再縮回，自血液流入毛細(xì)管內(nèi)開始計時，血液注滿后取出毛細(xì)管平放于桌上，每隔約30 s 依次折斷毛細(xì)管的兩端（約0.5 cm），并緩慢向左右拉開，觀察折斷處是否有血凝絲，至血凝絲出現(xiàn)為止，所經(jīng)歷時間即為凝血時間［10］，數(shù)據(jù)的平均值即為該小鼠的凝血時間。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，運用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)間比較采用獨立樣本t 檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 遠(yuǎn)志不同極性部位的HPLC 分析

液相條件：流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）梯度洗脫，洗脫梯度如下：20：80→24：76（0～10 min），24：76→28：72（10～30 min），28：72→31：69（30～35 min），31：69（35～45 min），31：69→35：65（45～50 min），35：65→40：60（50～51 min），40：60→43：57（51～64 min），43：57→20：80（64～68 min）；檢測波長：316 nm；采集時間：68 min；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；理論塔板數(shù)：以 3，6′-二芥子?；崽怯嫴坏陀?000。

2.2 遠(yuǎn)志不同極性部位的GC-MS 分析

分別稱取A、B、D 部位50 mg，各加入10 mL的玻璃試管中，分別加入2 mL 的甲醇-濃硫酸（10∶1）混合溶液，60 ℃水浴加熱 30 min，冷卻至室溫后，加入2 mL 正己烷與2 mL 蒸餾水振蕩萃取，待分層清晰后，分離上清液（正己烷層）作為分析試樣，進行GC-MS 分析。

2.3 小鼠凝血時間結(jié)果分析

阿司匹林、部位B、部位C、部位E 均能延長小鼠的凝血時間，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。雖然部位 B、部位 C、部位 E 均能延長小鼠凝血時間（P＜0.05）；與空白組相比，部位E的P 值為0.049，趨近于0.05；而部位B 與部位C的P 值則分別為0.018 和0.031；從P 值的大小來判斷，上述3 個部位的抗凝血作用仍有較大的差異。按抗凝血活性的強弱排列：部位C＞部位B＞部位E。

但是部位C 組中有5 只小鼠先后出現(xiàn)死亡，經(jīng)尸體解剖后發(fā)現(xiàn)，這5 只小鼠均出現(xiàn)了不同程度的胃腸道腫脹及腸脹氣。結(jié)果見表1，圖1。

表1 各提取部位對小鼠的凝血時間的影響

綜上，本研究將中藥材遠(yuǎn)志提取、分離成若干不同極性部位，經(jīng)體內(nèi)動物實驗證明，部位B 和部位C 的抗凝血活性優(yōu)于傳統(tǒng)水提物（部位E）。由于部位C 中所含的皂苷類成分較多，可能會引起一些不良反應(yīng)，諸如胃腸脹氣或腸道壞死等。

2.4 遠(yuǎn)志各分離部位的HPLC 分析

在遠(yuǎn)志各分離部位的HPLC 圖譜中，口山酮Ⅲ/3，6′-二芥子?；崽菫閷φ掌分刚J(rèn)［11］。結(jié)果見圖2。從圖2 中可以看出遠(yuǎn)志各極性部位化學(xué)信息差異較大。部位B 與部位C 在①②區(qū)的化學(xué)成分種類及含量明顯豐富其他部位。部位C 在③區(qū)與其他部位也明顯不同，顯示其皂苷含量明顯高于其他部位。

部位A 在③皂苷區(qū)域幾乎沒有峰，在①口山酮區(qū)與②寡糖酯區(qū)峰個數(shù)微乎其微。部位B 在口山酮區(qū)與糖酯區(qū)的峰及其多，而皂苷區(qū)的峰相對比較少。部位C 在口山酮區(qū)與糖酯區(qū)的峰與部位B 的峰相似，但皂苷區(qū)的峰比遠(yuǎn)志藥材甲醇提取物在此區(qū)域的峰個數(shù)都多，且含量較高。部位B、部位C 都有抗凝血作用，且前者的作用更優(yōu)，因此可以推測遠(yuǎn)志藥材抗凝血作用的有效部位應(yīng)該主要集中在口山酮區(qū)和糖酯區(qū)。結(jié)果見圖3。

圖2 遠(yuǎn)志不同極性部位的HPLC 疊加色譜圖

圖3 遠(yuǎn)志不同極性部位的HPLC 色譜圖

2.5 遠(yuǎn)志各分離部位的GC-MS 分析

從定性角度分析，A 部位與B 部位的總離子圖基本相似，結(jié)合NIST14.0 數(shù)據(jù)庫指認(rèn)了含量均較高的棕櫚酸（1）、亞油酸（2）、油酸（3）。此外，B部位中保留時間為21.25 的色譜峰高于A 部位，且B 部位中保留時間為23.02 和29.18 的色譜峰在A 部位中沒有。而C 部位中不含有棕櫚酸、亞油酸和油酸。結(jié)果見圖4。

藥效學(xué)實驗表明，部位B 有抗凝血活性，而部位A 沒有抗凝血活性。區(qū)別與部位A、部位B 中含有2 個含量相對較高的色譜峰，保留時間分別為23.02 min 和29.18 min，而這兩個色譜峰可能與部位B 的抗凝血活性密切相關(guān)。結(jié)果見圖5。

圖4 遠(yuǎn)志不同極性部位的GC-MS 總離子流圖

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，桃仁活血化瘀的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是油酸與亞油酸。故推測，遠(yuǎn)志中抗凝血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)可能也與油酸和亞油酸相關(guān)，油酸、亞油酸在其中起到了一定的輔助作用［9］。

3 討 論

本研究將遠(yuǎn)志藥材提取、分離成若干不同極性部位，經(jīng)體內(nèi)動物實驗證明遠(yuǎn)志乙酸乙酯部位、正丁醇部位與傳統(tǒng)水提物均有一定的抗凝血作用，且乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗凝血活性優(yōu)于傳統(tǒng)水提物。本研究也進一步對遠(yuǎn)志藥材不同極性部位進行了抗凝血藥理活性研究，從HPLC分析結(jié)果來看，抗凝血作用的活性物質(zhì)主要集中在口山酮區(qū)與糖酯區(qū)；從GC-MS 的結(jié)果來看，除了油酸和亞油酸以外，其他的脂肪酸類化合物應(yīng)該也是遠(yuǎn)志發(fā)揮抗凝血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。由此可見，遠(yuǎn)志藥材應(yīng)該是通過多種活性成分協(xié)同作用，通過不同作用環(huán)節(jié)協(xié)同發(fā)揮了抗凝血作用。

《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》等地方標(biāo)準(zhǔn)均記載了遠(yuǎn)志不同屬植物具有活血化瘀的藥用功效［12-20］，如黃楊遠(yuǎn)志亞屬中的黃花遠(yuǎn)志有補氣活血等功效；小扁豆亞屬中的長毛籽遠(yuǎn)志有活血、舒經(jīng)散血等功效；遠(yuǎn)志亞屬中的西南遠(yuǎn)志有活血止痛等功效。同科不同屬間的植物藥理作用應(yīng)該相似［21］。因此本研究得出遠(yuǎn)志乙酸乙酯部位、正丁醇部位與傳統(tǒng)水提物有一定的抗凝血作用這個結(jié)論與上述文獻(xiàn)及地方標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)論是保持一致的。

本研究僅對中藥材遠(yuǎn)志抗凝血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)進行了初步研究，因此遠(yuǎn)志具體的抗凝血活性機制還有待后續(xù)的研究。后續(xù)可針對遠(yuǎn)志的不同大類成分的抗凝血活性進行更全面的探索，以完善遠(yuǎn)志的抗凝血活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為日后遠(yuǎn)志的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，以開拓其更為廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。