周妍英 王蘭

摘要：以河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）血淋巴細胞為材料，不同濃度脂多糖（1.0、2.0、4.0和8.0μg/mL）分別刺激溪蟹12h、24h后，收集各處理組溪蟹血淋巴細胞進行試驗。利用多功能酶標儀測定酸性磷酸酶（ac-id phosphatase ， ACP ）、 堿性鱗酸酶（alkaline phosphatase ， AKP） 和 溶菌酶（lysozyme ， LSZ） 等溶酶體酶的活性及酚氧化酶（Phenoloxidase，P0）的活性;采用中性紅染色法測定溶酶體膜的穩(wěn)定性;采用實時焚光定量PCR法檢測紛氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）、溶菌酶2個基因mRNA表達水平的變化。結果表明：與空白對照組相比，注射脂多糖后，溪蟹血淋巴細胞酸性磷酸酶、堿性嶙酸酶、溶菌酶活性和酚氧化酶活性均有所升高;溶酶體酶膜穩(wěn)定性下降;在脂多糖注射24h后，酚氧化酶原和溶菌酶mRNA表達水平均有顯著上調。可見，脂多糖可以誘導河南華溪蟹血淋巴細胞溶酶體穩(wěn)定性下降并且釋放其中的溶酶體酶，免疫相關基因表達量上調，在一定程度上對溪蟹免疫能力有增強效果。

關鍵詞：免疫能力;脂多糖;河南華溪蟹

中圖分類號 S948 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2020）16-0128-05

隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，營養(yǎng)、環(huán)境和新陳代謝等急劇變化的應激條件容易對各類水生動物造成疾病，甚至死亡，給水產養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。以往使用各種抗生素來防治水生動物養(yǎng)殖病害，其負面影響較為嚴重，我國相關部門已逐步限制其在水產養(yǎng)殖業(yè)中的使用。近年來，對水生動物尤其是蟹類免疫機理的深入探索和認識，加上對免疫增強劑的研究，為水產養(yǎng)殖中病害防治開辟了一條新的思路[1]。為了防控水產養(yǎng)殖中出現(xiàn)的病害，國內外的一些學者開始將關注點投向了免疫增強劑。目前發(fā)現(xiàn)，多種化合物已經作為免疫增強劑投入到水產養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。

目前發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，不僅可以引起機體體液免疫應答，也可以提高機體的非特異性免疫功能，有效增強蝦蟹類、魚類免疫能力[4-7]，效果明顯，已被應用于水產養(yǎng)殖的相關研究。研究表明，脂多糖可以分別激活凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）[5]、中華絨螯蟹（Eriocheir si-nensis）[6]酚氧化酶原系統(tǒng)釋放酚氧化酶（Phenoloxidase，PO），進而將酚氧化成醌，最終形成黑色素，黑色素能夠使外來病菌和宿主隔離，從而達到免疫效果。還有文獻表明，脂多糖刺激鋸緣青蟹（Scylla paramamosain）血淋巴細胞免疫相關酶活性升高[7]，血細胞吞噬功能也增強。脂多糖作為飼料添加劑可以增加黑虎蝦（Alpheus bellulus）的存活率，誘導免疫相關基因的表達量上調[8]。王玉芬等[9]研究指出，竹筍多糖能增強中華絨螯蟹（Eriocheir si-nensis）的非特異性免疫反應，可添加在中華絨螯蟹詞料里來提高其免疫功能。趙紫越等[10]報道，黃芪多糖可以誘導中華絨螯蟹血細胞中的抗脂多糖因子、抗菌肽、酚氧化酶和Toll樣受體基因表達水平普遍上調，提高了蟹體免疫能力。此外，大黃多糖刺激擬穴青蟹（Scyllparamamo-sain）后，血清中非特異性免疫指標活性均顯著提高[11]。

甲殼動物缺乏免疫球蛋白，其體液免疫主要是一些非特異性的酶或其他免疫因子來共同完成的。據(jù)報道，甲殼動物血淋巴細胞主要分為顆粒細胞和無顆粒細胞兩大類，體液免疫因子酚氧化酶一般以酶原的形式即存在于顆粒細胞中[12，13]。當血細胞脫顆粒時，將酚氧化酶原釋放到胞外，被激活轉變成有活性的酚氧化酶。還有研究報道，溶酶體是甲殼動物血淋巴細胞中重要的亞細胞器。在一些外來物的刺激作用下，溶酶體酶的膜很容易破裂而釋放出其中的水解酶（酸性磷酸酶（acid phospha-tase，ACP ）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ，AKP） 和溶菌酶（lysozyme，LSZ）等），進一步發(fā)揮免疫作用[14]。本研究以河南華溪蟹（Sinopotamon henaneme）血淋巴細胞為試驗材料，用脂多糖作為免疫刺激劑，研究其對溪蟹免疫相關酶（酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶）活性、溶酶體膜的穩(wěn)定性、溶菌酶和酚氧化酶原基因mRN-NA表達水平的調節(jié)作用，探索脂多糖對溪蟹免疫功能的影響，以期為水產養(yǎng)殖病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 河南華溪蟹購自太原市五龍口水產批發(fā)市場。采用曝氣自來水，于循環(huán)系統(tǒng)的水族缸中暫養(yǎng)兩周以上，溫度為15～18℃，連續(xù)充氣，養(yǎng)殖密度為4～5只/L，每2d喂食1次。

1.1.2 主要試劑 脂多糖（E. Coli，055： B5，L2880，Sig-ma）;中性紅（Sigma）;乙醇、氯仿和異丙醇均為分析純;四種酶的活性及蛋白質含量測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。總RNA提取試劑盒（RNA isoPlus）、反轉錄試劑盒（Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser）、實時熒光定量PCR試劑盒PremkTaqTM（Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye）均為Takara試劑盒。ProO、LSZ和內參基因β-actin的引物均由上海生工有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 超低溫冰箱（Thermo Forma，美國）;冷凍離心機（Eppendorf 5804R，德國）;多功能酶標儀（Spec-tra max，M5，美國）。普通PCR儀（Eppendorf Mastercyclergradient，德國）、凝膠成像系統(tǒng)（Alpha FluorChem HD2，美國）、微量分光光度計（Eppendorf，Hamburg，德國）和實時熒光定量PCR儀（ABI 7500，美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 暫養(yǎng)結束后，隨機選取健康活潑和個體大小一致（平均濕重為20.0±0.5g）的，附肢完整的溪蟹個體，分成5組，每組10只個體。設置1個空白對照組（無菌生理鹽水）和4個脂多糖作用組，濃度分別是1.0、2.0、4.0和8.0μg/mL，刺激12h、24h，取血淋巴進行后續(xù)實驗。

1.2.2 樣品制備 將每組溪蟹個體分別置于冰上，用無菌注射器從溪蟹第4步足基部抽取血淋巴，將所取得的血液與等體積的抗凝劑同時裝入離心管混勻，離心棄上清，制成106的細胞懸液，0.5mL的樣品經液氮速凍，以備提取RNA用;一部分用于溶酶體膜穩(wěn)定性的測定;剩余的樣品-80℃保存，待用。

1.2.3 溶酶體膜的穩(wěn)定性將20μL的血細胞懸浮液放入離心管中，每管加入40μL的中性紅溶液（用TBS緩沖液配制成0.33%的液體），在10℃孵育2h，200g離心5min，用TBS緩沖液洗滌;加入200μL的混合液（1%冰醋酸：50%乙醇=1：1）混勻后，孵育。在多功能酶標儀上，測定其吸光值，結果用O.D./mg/mL蛋白來表示。

1.2.4 酶活性測定 ACP、AKP、LSZ和P0活性均依據(jù)南京建成試劑盒中說明書中的方法來測定。

1.2.5 proPO，LSZ mRNA表達水平的檢測以所有處理組合成的cDNA為模板，在實時熒光定量PCR儀上進行定量試驗。每個樣品重復3次進行定量。數(shù)據(jù)結果由公式2-△△Ct計算出基因的表達量。試驗所用引物序列見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計軟件SPSS20.0中的AN0VA法對各組間數(shù)據(jù)進行差異分析，其中P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有極顯著性差異。用軟件Origin 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 脂多糖對河南華溪蟹血淋巴細胞溶酶體膜穩(wěn)定性的影響 由圖1可知，脂多糖刺激溪蟹12h，血淋巴細胞溶酶體膜的穩(wěn)定性有所下降，其中，當脂多糖濃度是4.0μg/mL時，溶酶體膜的穩(wěn)定性較對照組相比顯著下降。脂多糖刺激溪蟹24h，脂多糖濃度分別是4.0和8.0μg/mL時，與對照組相比，血淋巴細胞溶酶體膜的穩(wěn)定性極顯著下降（P<0.01）。

2.3 脂多糖對河南華溪蟹血淋巴細胞酚氧化酶原基因表達水平的影響 由圖3可知，脂多糖刺激溪蟹后，血淋巴細胞中酚氧化酶原基因表達水平呈現(xiàn)上升趨勢。在脂多糖（2.0、4.0和8.0μg/mL）作用12h時，酚氧化酶原

2.2 脂多糖對河南華溪蟹血淋巴細胞ACP、AKP、LZM及PO活性的影響 由圖2可知，溪蟹血淋巴細胞中酸性磷酸酶活性隨著脂多糖注射濃度增加而逐漸升高，在脂多糖為4.0和8.0μg/mL時，酸性磷酸酶活性顯著升高。堿性磷酸酶活性和溶菌酶活性變化與酸性磷酸酶活性變化趨勢大體上一致（圖2B、2C）。當脂多糖注射時間延長至24h，除低濃度組（1.Oμg/mL）外，其他脂多糖濃度組作用下，堿性磷酸酶活性出現(xiàn)了極顯著升高（P<0.01）。溶菌酶活性在較高濃度的脂多糖（4.0和8.0μg/mL）作用時，也出現(xiàn)了顯著升高現(xiàn)象（P<0.05或者P<0.01）。從圖2D看出，隨著脂多糖作用時間延長，酚氧化酶活性一直升高。當脂多糖濃度是4.0μg/mL時，其活性達到峰值，在較高濃度8.0μg/mL時，酚氧化酶活性有所下降?；虮磉_水平分別是對照組的3.6、5.5、5.6倍。隨著作用時間延長至24h，酚氧化酶原基因表達水平一直升高，在較高濃度時，其表達水平達到對照組的8.6倍。

2.4 脂多糖對河南華溪蟹血淋巴細胞溶菌酶基因表達水平的影響 由圖4可知，在脂多糖（2.0和8.0μg/mL）作用12h時，溶菌酶基因表達水平分別是對照組的3.3和5.5倍（P<0.01）。隨著作用時間延長至24h，溶菌酶基因表達水平一直升高，在較高濃度（8.0μg/mL）時，其表達水平達到對照組的6.7倍。注射脂多糖后，溪蟹血淋巴細胞中溶菌酶基因表達水平整體上呈現(xiàn)上升趨勢。

3 討論

甲殼動物的免疫機能主要依賴非特異性免疫，由血淋巴細胞或者從血淋巴細胞釋放出來的免疫因子來共同完成。其中，血淋巴細胞中的亞細胞器溶酶體在免疫識別和防御中起著重要作用。溶菌酶是甲殼動物免疫系統(tǒng)中的重要成分，能夠水解革蘭氏陽性菌細胞壁的多糖，并使之水解釋放出來，形成水解酶體系，破壞和消除入侵外來物。酸性磷酸酶是動物體內巨噬細胞溶酶體的標志酶[15]，也是甲殼動物溶酶體酶的重要組成部分，它可以通過水解表面帶有磷酸酯的異物而破壞異物。堿性磷酸酶活性的提高，可以加速相應組織的物質代謝，為機體提供所需的無機磷，積累更多的能量。楊季芳等人報道，從南極海洋寡營養(yǎng)細菌提取的脂多糖能顯著提高三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血清中酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性[16]，免疫增強效果較好。同樣，本研究結果顯示，微量的脂多糖可以引起河南華溪蟹血淋巴細胞溶酶體膜穩(wěn)定性下降，溶酶體酶（酸性磷酸酶和堿性磷酸酶）活性升高，這與謝鵬關于脂多糖對凡納濱對蝦血細胞的研究結果也類似[17]。文英等研究發(fā)現(xiàn)，大黃多糖刺激擬穴青蟹后，血清中酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶和溶菌酶等非特異性免疫指標活性均顯著提高[11]，與本研究結果一致。

據(jù)報道，脂多糖可以刺激甲殼動物血淋巴細胞脫顆粒釋放免疫因子如酚氧化酶來增強機體免疫能力[18]。甲殼動物體內酚氧化酶激活系統(tǒng)在免疫識別和防御中發(fā)揮著關鍵作用，該系統(tǒng)以非活化狀態(tài)存在于顆粒細胞中，脂多糖可引起細胞胞吐作用，激活酚氧化酶原系統(tǒng)，伴隨著大量免疫活性因子的產生，通過多條途徑參與免疫作用。Soderhall等曾報道了脂多糖可以促使機體產生一種激活蛋白酶，從而使無活性的酚氧化酶原轉化為有活性的酚氧化酶[19]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃多糖刺激擬穴青蟹4d后，血細胞中的酚氧化酶原基因表達水平上調至對照組的2.1倍，酚氧化酶活性也顯著升高[11]。潘清清[20]。證實大黃多糖可顯著提高鋸緣青蟹血淋巴酚氧化酶活力，這與本論文中脂多糖刺激河南華溪蟹后，血淋巴細胞中酚氧化酶原表達水平上調，酚氧化酶活性也增加的結果相似。脂多糖可以通過改變梭子蟹血清中的溶菌酶活力及血細胞吞噬活性來提高梭子蟹的非特異性免疫功能[21]。還有研究報道，脂多糖能顯著提高三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）血清中溶菌酶活力[16]。尼羅羅非魚（Ore-chromis niloticus）在脂多糖刺激后，參與其非特異性免疫的結構域接合子蛋白（TIRAP）基因表達上調[22]。本研究結果表明，注射脂多糖后，河南華溪蟹血淋巴細胞中的溶菌酶基因表達水平上調，伴隨著溶菌酶活力也升高，這與上述報道結果是相同的。

綜上所述，脂多糖可以通過改變河南華溪蟹血清中的酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和酚氧化酶活力及免疫相關酶基因表達來提高溪蟹的非特異性免疫功能，但是否影響溪蟹血淋巴細胞的亞顯微結構，是否對非特異性免疫其他相關因子有影響，以及通過什么途徑來提高溪蟹免疫能力，還有待進一步研究。

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（責編：張宏民）

基金項目：山西省高等學?？萍紕?chuàng)新項目（2019L0844）;忻州師范學院科研基金項目（2018KY20）。

作者簡介：周妍英（1984-，女，山西人，博士，講師，研究方向：重金屬污染對水生動物毒性效應。 *通訊作者 收稿日期：2020-06-30