董 琪，張后才，劉飛翔，劉開放，吳文睿，方頌平

（亳州學(xué)院生物與食品工程系，安徽亳州 236800）

葛根為豆科多年生落葉藤本植物的干燥根莖，屬于衛(wèi)生部公布多年生豆科藤本藥食兩用植物，其含有豐富的淀粉、膳食纖維、氨基酸，以及對人體有益的微量元素，葛根素、大豆苷、蘆丁等異黃酮類物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)和藥用價值，素有“南葛北參”和“南方人參”之美譽。葛根黃酮類化合物具有治療心腦血管疾病、預(yù)防動脈硬化、抗癌、抗炎癥、舒張平滑肌等多種藥理作用，更值得關(guān)注的是，作為其中有效功能性成分之一的葛根素具有解酒護(hù)肝的功效[1-3]。

葛根作為提取淀粉或者黃酮的原料，沒有得到充分利用。而以葛根為原料制作發(fā)酵型保健酒時，其豐富的淀粉可為酒的轉(zhuǎn)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)，異黃酮類則可為“保健”提供物質(zhì)基礎(chǔ)。葛根酒是以鮮葛根或者葛根粉為原料,經(jīng)酶解糖化和酵母發(fā)酵或者直接由酒精浸提得到的一種低度酒，因其含有多種功能成分、營養(yǎng)全面、口感帶有濃郁的葛根清香，成為深受大家喜歡的保健酒之一。由于葛根酒是一種新興的保健酒，生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)工藝還存在釀造工藝繁瑣、成品酒中的葛根素含量低、原酒苦澀味如何去除、葛根酒專門酵母的選擇等問題[4]。濃醪發(fā)酵技術(shù)具有提高乙醇濃度、設(shè)備利用率高和降低能耗等優(yōu)勢，在釀酒領(lǐng)域得到較多的成功應(yīng)用[5-6]。因此，采用濃醪發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵型葛根酒的酒精度，較高的酒精度可增加醇溶性的葛根異黃酮含量[7]，并且較高的酒精度可抑制雜菌生長以防生酸，從而可通過后期陳釀改善口感風(fēng)味。濃醪發(fā)酵葛根酒的開發(fā)可為營養(yǎng)保健酒的開發(fā)提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

菌種：耐高溫釀酒高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；食品級耐高溫α-淀粉酶150000 U/g、食品級糖化酶260000 U/g，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院；硫酸、氫氧化鈉、酚酞、磷酸氫二鉀等均購于國藥；野生葛根粉、種植葛根粉購于亳州市中藥材交易市場；野生葛根淀粉，購于國森源葛粉實業(yè)有限公司。

儀器設(shè)備：UV-9000S 紫外分光光度計，上海元析；HH.S21-8-S 恒溫水浴鍋，上海躍進(jìn)；SPX-400-III 生化培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)；ME204E 電子分析天平，梅特勒；H2500R-2 高速冷凍離心機(jī)，湘儀；立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊；PE28-pH 計，梅特勒；GZX-9240MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊；K9860全自動凱氏定氮儀，海能。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝操作要點

1.2.1.1 液化

根據(jù)實驗所需，準(zhǔn)確稱取粉碎過篩后的原料，并根據(jù)料液比，將所需自來水加入錐形瓶中，緩緩加入稱量好的原料，邊加入邊攪拌，以防結(jié)團(tuán)；再分別加入KH2PO40.125 g/L；用硫酸將pH 值調(diào)節(jié)至5.5，按30 U/g 原料，向瓶中加入耐高溫α-淀粉酶，放入沸水浴中進(jìn)行液化，每隔一定時間搖勻1 次，90 min后經(jīng)碘試無藍(lán)色，便取出。

1.2.1.2 糖化

將液化后的醪液冷卻至60 ℃，調(diào)節(jié)pH4.5，按260 U/g 原料，加入糖化酶，混勻后，于60 ℃水浴鍋中保溫一定時間。

1.2.1.3 發(fā)酵

將糖化后的醪液冷卻至30 ℃以下，按原料的0.5 ‰，加入活性干酵母，然后放于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，直至無氣泡產(chǎn)生。

1.2.1.4 酒液的制備

發(fā)酵結(jié)束后，使用冷凍離心機(jī)，在8000 r/min，5 ℃下離心10 min，取上清酒液，用于酒精度、酸度和總黃酮的測定。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 野葛全粉與野葛淀粉比例對葛根酒的影響

野葛全粉和野葛淀粉按照1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5進(jìn)行調(diào)配，按淀粉含量進(jìn)行換算，使調(diào)配后的淀粉含量分別為57%、63%、67%和70%，再分別調(diào)整料液比，使得發(fā)酵初始淀粉溶液濃度為20 g/100 mL，發(fā)酵結(jié)束后測定酒樣酒精度和總黃酮含量。

1.2.2.2 料液比對葛根酒的影響

采用野葛全粉和野葛淀粉按照一定比例調(diào)配后，按1∶2.0、1∶1.8、1∶1.6、1∶1.4 和1∶1.2 的料液比進(jìn)行處理發(fā)酵，直至無顯著氣泡產(chǎn)生，發(fā)酵結(jié)束，測定各項指標(biāo)。

1.2.2.3 糖化時間對濃醪發(fā)酵型葛根酒的影響

野葛全粉和野葛淀粉按照一定比例調(diào)配后，料液比按1∶1.6，考察糖化時間0 min、15 min、30 min、45 min和60 min對發(fā)酵后葛根酒質(zhì)量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化料液比和糖化酶用量

從以上實驗發(fā)現(xiàn)糖化過程和料液比對濃醪發(fā)酵葛根酒的酒度和總黃酮含量影響較大，因此本實驗采用中心組合設(shè)計（CCD）原理，以料液比和糖化酶用量為響應(yīng)變量，以酒度和總黃酮含量為響應(yīng)值，進(jìn)行2 因素3 水平響應(yīng)面分析實驗。實驗方案設(shè)計見表1，然后按1.2 中的實驗方法進(jìn)行液化，糖化工藝改為：液化結(jié)束后，降溫至30 ℃，再加入不同水平的糖化酶。發(fā)酵結(jié)束后，測定各指標(biāo)。

表1 中心組合設(shè)計水平及編碼

1.2.4 原料成分分析

均采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法：淀粉，GB 5009.9—2016酶水解法；蛋白質(zhì)，GB 5009.5—2016 凱氏定氮法；粗脂肪，GB 5009.6—2016 索氏抽提法；灰分，GB 5009.4—2016 食品中總灰分的測定；水分，GB 5009.3—2016直接干燥法。

1.2.5 葛根總黃酮的測定

紫外分光光度法[8]。以75%vol 的乙醇將葛根素稀釋至合適的濃度梯度，在250 nm 處測吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酒液總黃酮的測定，采用75 %vol乙醇稀釋至合適倍數(shù)后，直接測定。葛根中總黃酮的測定，采用75 %vol 乙醇，經(jīng)超聲提取、過濾、定容，并稀釋到合適倍數(shù)后測定。

1.2.6 酒精度和酸度的測定

酒精度：密度計法[9]。酸度：10 mL酒液，以酚酞為指示劑，用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液為1 度。吸取酒液1 mL，加入250 mL 三角瓶中，加水50 mL，加酚酞指示劑2 滴，用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定至溶液呈微紅色并在30 s內(nèi)不褪色為終點[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根成分分析

野葛和粉葛均含有大量的淀粉和葛根異黃酮等功能性成分。由表2 可見，野葛和粉葛在淀粉和總黃酮上差異較大，野葛淀粉含量達(dá)到26%，粉葛淀粉含量為51%；但野葛中的總黃酮為12.7%，遠(yuǎn)大于粉葛的2.4%。該結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報道的結(jié)果相類似[11-12]。

葛根中淀粉含量，遠(yuǎn)低于谷物，故純葛根發(fā)酵后的酒度較低，口感較差，并且葛根素等黃酮類物質(zhì)在水中的溶解度沒有醇溶液的高，因此提高發(fā)酵的終酒度有利于葛根素的溶出[7，13]。為了提高酒精度，則需要提高料液比，或增加醪液的總淀粉含量。因此近些年文獻(xiàn)報道的葛根酒，多為葛根與高粱、糯米、玉米、大米等常用釀酒原料一起混合發(fā)酵，有的則直接配入蔗糖或葡萄糖，以提高發(fā)酵的酒精度和產(chǎn)品的口感。但加入較高比例的谷物，會使葛根素等異黃酮類的終濃度下降。在不添加外源糖類物質(zhì)葛根酒的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比小于1∶3 進(jìn)行調(diào)漿時，發(fā)現(xiàn)醪液較黏稠，主要原因是葛根中含有大量的纖維素，吸水性強，從而影響后續(xù)液化和糖化。因此為了從根本上解決發(fā)酵葛根酒的品質(zhì)問題，獲得酒精度和功能性成分含量較高的葛根酒，本實驗采用野葛全粉和野葛淀粉（淀粉88.6%，葛根素≥75 mg/kg）配伍，進(jìn)行濃醪發(fā)酵。

表2 野葛和粉葛主要組成成分分析 (g/100 g)

2.2 野葛全粉與野葛淀粉比例對葛根酒的影響（表3）

表3 野葛全粉和野葛淀粉比對葛根酒酒精度和葛根總黃酮的影響

由表3可知，在野葛全粉和淀粉的不同配比下，葛根酒的酒精度無顯著性差異，均在13.3 %vol～13.7%vol 之間。但總黃酮含量卻隨野葛全粉占比的減小，從19.8 mg/mL 減少至7.4 mg/mL。這主要是由于野葛全粉中的總黃酮含量遠(yuǎn)大于其淀粉中總黃酮的含量，因此在葛根全粉占比減小時，總黃酮的含量逐漸降低。為此，在考慮配伍后的淀粉濃度的情況下，野葛全粉和野葛淀粉的配比選用1∶1。

2.3 料液比對葛根酒的影響（圖1）

圖1 料液比對葛根酒質(zhì)量的影響

如圖1 所示，隨著料液比的增加，葛根酒中的酒精度略有上升，但從1∶1.8后顯著降低；總黃酮含量隨料液比增加而略增加，但酸度也隨之增加。實驗結(jié)果表明，料液比增大，可為乙醇發(fā)酵提供碳源來源，但是當(dāng)增加到一定程度后，由于方法中的糖化時間較長，過大的料液比會使糖化后的葡萄糖濃度增高，初期過高的滲透壓影響酵母的生長代謝，同時產(chǎn)生有機(jī)酸等副產(chǎn)物[14-15]。由于有機(jī)酸的增加，本實驗中的酸度值隨料液比的增大而增大。此外，由于料液比的增大，會使原料中的總黃酮濃度增大，酒液中的總黃酮濃度也隨之增大。因此，糖化程度和料液比是葛根濃醪發(fā)酵的兩個重要因子。

2.4 糖化時間對濃醪發(fā)酵型葛根酒的影響（圖2）

圖2 糖化時間對濃醪發(fā)酵型葛根酒的影響

目前許多文獻(xiàn)中葛根糖化工藝均使醪液中的淀粉一次性均轉(zhuǎn)化為可利用的還原性糖類。但對于濃醪發(fā)酵，醪液經(jīng)糖化后就會增加初始糖濃度和體系滲透壓，較高的滲透壓會降低細(xì)胞膜中磷脂雙分子層的流動性，底物難以進(jìn)入細(xì)胞中，乙醇也難以擴(kuò)散到胞外，糖酵解途徑酶的活性也被抑制，酵母的發(fā)酵力和活性下降，抑制了乙醇的生成，同時產(chǎn)生副產(chǎn)物，從而不利于酵母的生長和乙醇的代謝[15]。邊糖化邊發(fā)酵工藝（SSF）可防止醪液的滲透壓升高，例如李志軍等[16]以玉米為原料添加20 U淀粉酶/g 原料，90～95 ℃液化，采用邊糖化邊發(fā)酵工藝，發(fā)酵酒度達(dá)到13.6%vol。

由圖2 可知，隨著糖化時間的增加，酒精度和總黃酮含量均逐漸下降，而酸度逐漸升高。在本實驗料液比一定的情況下，隨著糖化時間的增加，初始糖濃度逐漸增加，過高的糖濃度，使前期發(fā)酵過快，產(chǎn)熱和產(chǎn)酸增大，同時會增加發(fā)酵液的滲透壓，這些都會影響酵母的正常生長代謝。當(dāng)液化結(jié)束時，醪液中已經(jīng)含有相當(dāng)濃度的單糖，因此糖化時間為0 min 時，即采用邊糖化邊發(fā)酵工藝（SSF），酵母依然有可利用的單糖。此后，在糖化酶的作用下，低分子量的糊精和寡糖分子逐漸被水解成單糖，從而解除了濃醪發(fā)酵過程中，初始糖濃度過高對乙醇發(fā)酵的不利影響。此外有文獻(xiàn)表明[7]，酒精度的增加會促進(jìn)酒液中總黃酮含量的增加，這主要是由于葛根異黃酮類物質(zhì)更易溶于乙醇，這與本實驗結(jié)果相符。

2.5 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化料液比和糖化酶用量

從以上實驗發(fā)現(xiàn)糖化過程和料液比對濃醪發(fā)酵型葛根酒的酒精度和葛根總黃酮含量影響較大，因此本實驗采用中心組合設(shè)計（CCD）原理，實驗結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面中心組合設(shè)計和實驗結(jié)果

2.5.1 酒度響應(yīng)值回歸模型的方差分析

利用Dsign-expert 對表4 中的酒度值數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到的編碼二次多項式方程為：Y=15.02-0.27A-0.14B-0.075AB-1.64A2-0.34B2（1）

由公式（1）中的系數(shù)和圖3 可知，該方程的拋物面向下，該模型有最大值。采用Design-expert 對酒精度值進(jìn)行多元回歸分析，方差分析結(jié)果見表5。如表5 所示，該模型P 值遠(yuǎn)小于0.05，表明該模型在95 %的概率水平下是顯著的；該模型的失擬項為P=0.4227，大于0.05，不顯著，表明未知因素對該模型實驗結(jié)果的干擾較小，不需要再引入其他的因素；且該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9606，表明了酒精度值的變化有96.06 %的概率是由該模型決定的，并說明實驗中酒精度的實際值與模型預(yù)測值有較高的一致性。因此，該模型較能準(zhǔn)確的對實驗結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。

圖3 酒精度響應(yīng)面三維圖

表5 酒精度響應(yīng)值的二次多項式回歸模型的方差分析

2.5.2 葛根總黃酮響應(yīng)值的回歸模型的方差分析

利用Dsign-expert 對表4 中的總黃酮數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到的編碼二次多項式方程為：Y=25.06+2.67A-0.58B-0.025AB-1.25A2-0.85B2（2）

由公式（2）中的系數(shù)和圖4 可知，該方程的拋物面向下，該模型有最大值。采用Design-expert 對酒精度值進(jìn)行多元回歸分析，方差分析結(jié)果見表6。如表6 所示，該模型P 值為0.0016，遠(yuǎn)小于0.05，表明該模型在95 %的概率水平下是顯著的；而該模型的失擬項P 值為0.6671，大于0.05，不顯著，表明未知因素對該模型實驗結(jié)果的干擾較小，不需要再引入其他的因素；且該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9081，表明了酒精度值的變化有90.81 %的概率是由該模型決定的，并說明實驗中酒精度的實際值與模型預(yù)測值有較高的一致性。因此，該模型較能準(zhǔn)確的對實驗結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。

圖4 總黃酮響應(yīng)面三維圖

表6 葛根總黃酮響應(yīng)值的二次多項式回歸模型的方差分析

2.5.3 最優(yōu)條件的確定與驗證

采用Design-expert 在同時考慮酒精度和葛根總黃酮含量的情況下，得出最優(yōu)條件為料液比0.63（1∶1.587），糖化酶用量為256.2 U/g，此時的酒精度預(yù)測值為14.8%vol，總黃酮預(yù)測值為25.8 mg/mL。在該最優(yōu)條件下進(jìn)行實驗，酒精度實測值為15.2 %vol，總黃酮實測值為25.9 mg/mL，該值與預(yù)測值接近。

3 結(jié)果與討論

在考察了野葛和粉葛基本組成成分的基礎(chǔ)上，采用野葛全粉和野葛淀粉配伍進(jìn)行濃醪發(fā)酵葛根酒的研制，以發(fā)酵后酒液的酒精度和總黃酮的含量為目標(biāo)，對野葛全粉和野葛淀粉的配伍比例、料液比、糖化時間進(jìn)行初步優(yōu)化，并使用響應(yīng)面中心組合實驗確定料液比和糖化酶的用量，得到最佳工藝條件為：野葛全粉和野葛淀粉按1∶1 配比，料液比為1∶1.587，糖化酶用量為256.2 U/g，糖化時間為0 min時，酒精度為15.2 %vol，總黃酮為25.9 mg/mL，在此條件下，酒精度和總黃酮含量均較高。

野葛和粉葛在淀粉和總黃酮含量差異較大，其中野葛的總黃酮含量遠(yuǎn)高于粉葛，在制備葛根產(chǎn)品時，應(yīng)根據(jù)實際需要選用合適的品種。為了獲得活性成分高的葛根酒，應(yīng)選用野葛進(jìn)行發(fā)酵。為了克服野葛全粉中淀粉含量低的缺陷，采用與野葛淀粉配伍使用，進(jìn)行發(fā)酵，取得較好結(jié)果。料液比和糖化程度對葛根酒的酒精度和總黃酮含量影響較大。其中，料液比過大時，雖然一定程度上可提高總黃酮的含量，但過高時，由于醪液過于濃稠，初始糖濃度大，滲透壓高，反而不利于發(fā)酵。當(dāng)糖化時間為0 min，即采用邊糖化邊發(fā)酵工藝后，可顯著解決葛根濃醪發(fā)酵過程的這一問題。并采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計，對料液比和糖化酶的用量做出了更為精確的優(yōu)化，取得較好效果。但野葛中含有大量的纖維素成分，該成分很大程度上阻礙了葛根酒的酒精度和總黃酮含量的提升，因此在發(fā)酵過程中可對去除或轉(zhuǎn)化纖維素進(jìn)一步研究。