劉高峰，張明宇，黃光輝，趙成坤，李小龍，李秋英，王巖

(1.南平市煙草公司邵武分公司，福建 邵武 354000;2.鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南 鄭州 450001)

煙草青枯病是由茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一種具有嚴(yán)重危害的細(xì)菌性土傳病害，在中國南方煙區(qū)普遍發(fā)生[1]。一旦發(fā)病即可造成全株死亡，對(duì)煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量造成極大影響，成為不少地區(qū)煙葉生產(chǎn)發(fā)展的制約因素[2]。煙草青枯病的發(fā)生、流行和危害是諸多因素綜合作用的結(jié)果，以往對(duì)煙草青枯病的研究和防控主要集中在抗性品種選育、化學(xué)藥劑防控及改善栽培管理等方面[3-5]。雖然各種防控措施均能起到一定效果，但這些防控措施也存在著選育周期長、環(huán)境污染、輪作受土地資源限制等諸多問題[6]。目前，生物防控土傳病害主要是通過施用拮抗菌或生物有機(jī)肥等措施調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)、改善土壤微生物多樣性、抑制病原菌的生長或提高植物自身抗性，從而抑制土傳病害的發(fā)生[7]。石灰氮是一種具有補(bǔ)充Ca，Mg等中量元素、改良土壤和土壤殺菌等多種功效的氮素肥料[8]。石灰氮在土壤中緩慢水解生成氫氧化鈣和氰胺，氰胺對(duì)土壤微生物具有較強(qiáng)的殺滅作用，并逐漸水解形成尿素或氨直接被植物吸收[9]。以往的研究表明，施用石灰氮能有效改善土壤理化性狀和防治土傳病害[10]。但石灰氮施用對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等產(chǎn)生的影響方面研究較少。此外，石灰氮在土壤中的滅殺作用是無選擇的，會(huì)使消毒后的土壤形成“生物真空”。因此，施用石灰氮對(duì)土壤消毒后如不及時(shí)填補(bǔ)這一“生物真空”，常會(huì)因農(nóng)事操作不當(dāng)重新將病原菌帶入土壤，并且由于此時(shí)的土壤失去了生物間的相互制約，被帶入的病原菌常會(huì)爆發(fā)式增長，并導(dǎo)致更加嚴(yán)重的病害發(fā)生，所以，土壤消毒后及時(shí)增加土壤微生物數(shù)量和種類，形成有大量有益微生物存在的微生態(tài)環(huán)境，則是保持土壤消毒效果和防止病害復(fù)發(fā)的最佳方法。為此，本試驗(yàn)將石灰氮與生物菌劑配合施用于煙田，旨在通過煙株移栽前施用石灰氮?dú)鐭熖锿寥乐械牟≡跓熤陥F(tuán)棵期施用生物菌劑，以期改變煙株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)，實(shí)現(xiàn)防控?zé)煵萸嗫莶〉哪康摹?/p>

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年2—7月在福建省邵武市沿山鎮(zhèn)煙草基地進(jìn)行。邵武屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，日照充足，雨量充沛，常年平均降雨量1 800 mm，年平均氣溫18 ℃，試驗(yàn)地點(diǎn)海拔200～250 m。試驗(yàn)期間平均氣溫28.5 ℃。

1.2 試驗(yàn)材料

供試烤煙品種為K 326，試驗(yàn)地前茬作物為水稻。供試煙田在移栽前以條溝方式施用牛糞1 500 kg·hm-2，鈣鎂磷肥450 kg·hm-2，移栽時(shí)施煙葉專用肥465 kg·hm-2(m(N)∶m(P)∶m(K)=12.5∶8∶22.5)，團(tuán)棵期追施硝酸鉀375 kg·hm-2，旺長期硫酸鉀270 kg·hm-2。煙田土壤質(zhì)地為沙質(zhì)壤土，土壤pH值為5.3，有機(jī)質(zhì)含量為22.9 g·kg-1,堿解氮含量為124.7 mg·kg-1，速效鉀含量為201.1 mg·kg-1，有效磷含量為215.6 mg·kg-1。

1.3 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)共分為3個(gè)處理，每個(gè)處理小區(qū)面積為666.7 m2。T1為空白處理，按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)施肥與管理，即只施煙葉專用肥、化肥、有機(jī)肥；T2在T1基礎(chǔ)上于移栽前15 d首次樣品采集后施用石灰氮675 kg·hm-2(施入的氮量完全替代煙葉專用肥中的氮素)；T3在T2基礎(chǔ)上于團(tuán)棵期樣品采集后施用生物菌劑45 kg·hm-2(拮抗菌選用解淀粉芽孢桿菌B1619，含活菌數(shù)≥109·g-1)。試驗(yàn)用石灰氮為灰白色粉末，氮素含量為20%，CaO含量為 35%，pH值為11.5。該肥料在土壤中養(yǎng)分釋放相對(duì)緩慢，因而肥效高。

分別在移栽前(編號(hào)YZ)、團(tuán)棵期(編號(hào)TK)、旺長期(編號(hào)WZ)和成熟期(編號(hào)CS)4個(gè)時(shí)期采取煙草根際土壤進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理3次重復(fù)。采用S型五點(diǎn)取樣法(不少于5株)采取煙株根際土壤，取樣時(shí)首先去除煙株根部表層土壤，以煙株莖部為中心直徑10 cm左右、深10 cm左右處的土壤進(jìn)行取樣。取樣后用密封袋低溫封存，用15 mL離心管裝滿，送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對(duì)微生物進(jìn)行基因測(cè)序。

1.4 測(cè)定內(nèi)容及方法

1.4.1 病情測(cè)定 為了評(píng)估試驗(yàn)處理對(duì)煙草青枯病的防治效果，在煙株移栽后每隔10 d記載發(fā)病情況，計(jì)算青枯病的發(fā)病率、病情指數(shù)和防控率。青枯病病情指數(shù)的分級(jí)調(diào)查按照《GB/T 23222—2008煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》進(jìn)行。

發(fā)病率=(發(fā)病株數(shù) / 總株數(shù))×100%；

病情指數(shù)=(∑各級(jí)病株數(shù)或葉數(shù)×該病級(jí)值)/ (調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高級(jí)值) ×100%；

防控效果= (對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/ 對(duì)照病情指數(shù)×100 %

1.4.2 微生物基因測(cè)序 土壤微生物基因測(cè)序采用第2代高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)煙株不同生育時(shí)期的土壤樣本進(jìn)行細(xì)菌(16 S rDNA)和真菌(18 S rDNA)序列檢測(cè)。DNA 抽提及PCR擴(kuò)增、Illumina Miseq 測(cè)序、數(shù)據(jù)處理等方法參見陳乾錦等[11]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

微生物數(shù)量采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，顯著性分析采用SPSS Statistics 20.0。測(cè)序數(shù)據(jù)在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的I-Sanger生物信息分析云平臺(tái)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石灰氮與生物菌劑對(duì)土壤微生物群落的影響

2.1.1 石灰氮與生物菌劑對(duì)土壤微生物群落組成的影響 如圖1-a所示，對(duì)細(xì)菌門水平上相對(duì)豐度排名前10的物種進(jìn)行Heatmap分析。如果將相對(duì)豐度>10 %的細(xì)菌劃分為優(yōu)勢(shì)類群，則樣本中共有4種優(yōu)勢(shì)菌種，其相對(duì)豐度占樣本總量的80 %以上。對(duì)優(yōu)勢(shì)類群在各個(gè)時(shí)期進(jìn)行分析的結(jié)果表明，酸桿菌門(Acidobacteria)在團(tuán)棵期T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為8.9%，12.6%，10.4%，進(jìn)入旺長期后相對(duì)豐度分別為13.9%，10.5%，11.9%，進(jìn)入成熟期后分別為7.5%，10.8%，8.5%；變形菌門(Proteobacteria)在旺長期T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為29.1%，33.8%，30.0%，進(jìn)入成熟期后分別為27.2%，25.0%，29.4%；放線菌門(Actinobacteria)僅成熟期在處理與對(duì)照中表現(xiàn)出差異，T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為30.6%，24.6%，27.2%；綠彎菌門(Chloroflexi)在旺長期的T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為22.2%，17.3%，22.4%，進(jìn)入成熟期后分別為18.0%，21.8%，18.3%。對(duì)于非優(yōu)勢(shì)菌種而言，厚壁菌門(Firmicutes)在旺長期T1，T2，T3中分別為4.1%，6.1%，5.4%；芽孢桿菌門(Gemmatimonadetes)在團(tuán)棵期T1，T2，T3中分別為2.6%，1.9%，2.0%；硝化螺旋菌門(Nitrospirae)在團(tuán)棵期的對(duì)照組與處理組中表現(xiàn)出明顯差異，T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為1.2%，1.6%，1.7%；糖化細(xì)菌門(Saccharibacteria)在整個(gè)煙株生長期內(nèi)均表現(xiàn)為處理組明顯低于對(duì)照組。這表明移栽前施用石灰氮，在團(tuán)棵期會(huì)增加煙株根際土壤中酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度，而減少了芽孢桿菌門(Gemmatimonadetes)、糖化細(xì)菌門(Saccharibacteria)的相對(duì)豐度。團(tuán)棵期生物菌劑的施用，則改變了旺長期與成熟期煙株根際土壤中變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)等的相對(duì)豐度。

如圖1-b所示，在真菌門水平上共有2種優(yōu)勢(shì)菌種。子囊菌門(Ascomycota)在團(tuán)棵期T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為62.0%，80.3%，76.9%，旺長期相對(duì)豐度分別為75.8%，81.9%，79.5%，成熟期相對(duì)豐度分別為81.8%，89.2%，88.5%；擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在團(tuán)棵期T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為8.6%，10.3%，14.7%，成熟期相對(duì)豐度分別為8.9%，6.8%，6.8%。對(duì)于非優(yōu)勢(shì)菌種而言，unclassified_d__Eukaryota在整個(gè)煙株生長期內(nèi)均表現(xiàn)為處理組明顯低于對(duì)照組，在團(tuán)棵期T1，T2，T3中的相對(duì)豐度分別為12.5%，1.4%，1.3%，旺長期分別為3.5%，0.9%，0.8%，成熟期分別為3.6%，0.6%，0.6%。這表明施用石灰氮可以在旺長期增加真菌中優(yōu)勢(shì)菌種的相對(duì)豐度，而在整個(gè)煙株生長時(shí)期內(nèi)抑制unclassified_d__Eukaryota的生長。

2.1.2 石灰氮與生物菌劑對(duì)煙株根際土壤微生物Alpha多樣性的影響 環(huán)境中微生物的多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和勻質(zhì)性。Cove-rage指數(shù)是指各樣本文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高說明樣本中序列被測(cè)出的概率越高，樣本具有代表性。本試驗(yàn)中各樣本細(xì)菌及真菌的Coverage值都在93%以上，表明本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況。各個(gè)時(shí)期及處理的Alpha多樣性如表1所示。對(duì)于細(xì)菌來說，團(tuán)棵期的處理中無論是Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)，還是Ace指數(shù)均明顯高于對(duì)照組。表明移栽前施用石灰氮在團(tuán)棵期能增加煙株根際土壤細(xì)菌的物種數(shù)量，群落多樣性及群落豐度。旺長期的處理各指數(shù)均低于對(duì)照組，且T2低于T3。成熟期在T1，T2中Sobs指數(shù)分別為2 964，3 158(P<5%)，Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)均表現(xiàn)為處理組明顯高于對(duì)照組。真菌各指數(shù)在成熟期之前均未表現(xiàn)出明顯差別，成熟期Sobs指數(shù)在T1，T2，T3中分別為341，285，286(P<5%)，Shannon指數(shù)在T1，T2，T3中分別為3.16，2.51，2.94，Ace指數(shù)在T1，T2，T3中分別為417，359，340。這表明，施用石灰氮在成熟期能減少煙株根際土壤真菌的物種數(shù)量和多樣性。

注：a.細(xì)菌門；b.真菌門。橫坐標(biāo)為樣本名(或分組名)，縱坐標(biāo)為物種名，通過色塊顏色梯度來展示樣本中不同物種的豐度變化情況。圖中右側(cè)為顏色梯度代表的數(shù)值。Note:a.Bacteria phylum;b.Fungi phylum.The abscissa is the sample name (or group name),and the ordinate is the species name.The change of abundance of different species in the sample is shown by the color gradient of the color block.The value represented by the color gradient is on the right of the figure.圖1 煙株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在門水平上的Heatmap圖Fig.1 Heatmap of microbial community structure in rhizosphere soil of tobacco plant at phylum level

表1 煙株根際土壤微生物Alpha多樣性變化Table 1 Changes of microbial alpha diversity in rhizosphere soil of tobacco plants

續(xù)表1 Contuning table 1

2.1.3 石灰氮與生物菌劑對(duì)煙株根際土壤微生物Beta多樣性的影響 PCA 主成分分析能夠反映不同調(diào)控措施下煙株根際土壤微生物群落的變化情況。圖2a為細(xì)菌屬水平上的PCA圖，團(tuán)棵期T1，T2，T3中群落組成差異并不明顯，旺長期T1與T2，T3之間群落組成出現(xiàn)明顯差異，而T2，T3群落組成差異不明顯，成熟期不僅T1與T2，T3之間群落組成差異更大，而且T2與T3群落組成開始表現(xiàn)出差異。這表明施用石灰氮對(duì)煙株根際土壤細(xì)菌群落的影響在旺長期開始表現(xiàn)，而混合施用生物菌劑則是成熟期才表現(xiàn)出差異。圖2b為真菌屬水平PCA圖，團(tuán)棵期T1與T2，T3的群落組成就開始表現(xiàn)出差異，旺長期其差異更加明顯，而施用生物菌劑的處理T3與T2相比群落組成差異并不明顯。這表明施用石灰氮對(duì)煙株根際土壤中細(xì)菌、真菌的群落結(jié)構(gòu)均具有明顯影響，而施用生物菌劑對(duì)煙株根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響更大。

注：a.細(xì)菌屬水平；b.真菌屬水平。Note:a.Becteria genus level;b.Fungi genus level.圖2 煙株根際土壤微生物PCA圖Fig.2 PCA diagram of soil microorganisms in rhizosphere of tobacco plant

2.1.4 石灰氮與生物菌劑對(duì)煙株根際土壤中青枯病病原菌的影響 對(duì)煙株不同生長時(shí)期及不同處理中煙株根際土壤中病原菌進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。移栽前植煙土壤中病原菌豐度為0.003 2%，團(tuán)棵期T1中病原菌幾乎沒有，T2，T3中含量均為0.004 7%，這可能是由于石灰氮采用條施后起壟的方式導(dǎo)致石灰氮與土壤混合不均勻，從而影響了石灰氮?dú)绮≡淖饔?。進(jìn)入煙株生長的旺長期后石灰氮處理中的病原菌含量仍高于對(duì)照，T2高于T3。但是進(jìn)入成熟期后青枯病病原菌在T1，T2，T3中的豐度分別為0.029 9%，0.014 2%，0.009 5%，對(duì)照中病原菌豐度顯著高于處理組。這表明石灰氮及生物菌劑的施用在煙草成熟期后才表現(xiàn)出顯著降低煙株根際土壤中病原菌相對(duì)豐度的作用。比較而言，石灰氮與生物菌劑配合施用(T3)對(duì)降低病原菌豐度的效果最好。

表2 煙株根際土壤中病原菌豐度Table 2 Relative abundance of pathogenic bacteria in rhizosphere soil of tobacco plant

2.2 施用石灰氮與生物菌劑對(duì)青枯病發(fā)病率的影響

試驗(yàn)田成熟期青枯病的發(fā)病率如表5所示，處理組中發(fā)病率明顯低于對(duì)照組。這可能是由于處理組在石灰氮施加后，煙株根際土壤中功能菌含量增多，微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)改變，土壤肥力增加的結(jié)果。而在T2中發(fā)病率為43.2 %，防控效果為45.3 %，T3中發(fā)病率為36.7 %，防控效果為58.8 %，表明施用石灰氮能顯著降低煙草青枯病的發(fā)病率，而石灰氮與生物菌劑復(fù)合施用效果最好。這可能是生物菌劑的施用進(jìn)一步降低了煙株根際土壤中病原菌的相對(duì)豐度，并且抑制了其他有害菌增殖的結(jié)果。

表3 施用石灰氮及生物菌劑對(duì)煙草青枯病的防控效果Table 3 Control effect of application of lime nitrogen and biological fertilizer on tobacco bacterial wilt

3 結(jié)論與討論

移栽前施用石灰氮顯著改變了煙株根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，團(tuán)棵期優(yōu)勢(shì)菌種中變形菌門(Proteoacteria)，綠彎菌門(Chloroflexi)，酸桿菌門(Acidobacteria)相對(duì)豐度增加，放線菌門(Actinobacteria)相對(duì)豐度降低，非優(yōu)勢(shì)菌種硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度增多，糖化細(xì)菌門(Saccharibacteria)的相對(duì)豐度顯著降低(P<5%)。硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度增多可能與石灰氮的分解有關(guān)，硝化螺旋菌屬可以將硝化菌氧化土壤氨生成的亞硝酸繼續(xù)氧化成硝酸鹽，而硝酸鹽是土壤中作物易吸收的氮源形式，因此，土壤中硝化螺旋菌的增加可以間接地增加土壤肥力[12]。推測(cè)土壤肥力的增加可能是團(tuán)棵期煙株根際土壤微生物群落中物種數(shù)目，群落多樣性及群落豐度升高的原因。有研究結(jié)果顯示，煙草發(fā)病土壤中糖化細(xì)菌門(Saccharibacteria)的豐度較高[13]，而團(tuán)棵期糖化細(xì)菌門(Saccharibacteria)相對(duì)豐度的顯著降低。這可能是由于石灰氮遇水分解后所生成的氰胺對(duì)土壤中的真菌、細(xì)菌等有害生物具有廣譜性的殺滅作用，而起壟后覆蓋地膜，在日光照射下可以提高土壤溫度，經(jīng)過熱力滅菌作用，達(dá)到殺死土壤有害生物的目的[14]。但病原菌豐度的差異性檢驗(yàn)顯示，團(tuán)棵期的處理組中病原菌豐度反而高于對(duì)照。這可能是由于石灰氮采用條施后起壟的方式導(dǎo)致石灰氮與土壤混合不均勻，從而影響了石灰氮?dú)绮≡淖饔?。研究表明，土壤微生物種群和數(shù)量影響青枯菌數(shù)量和青枯病的發(fā)生，通過調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)可起到抑制土傳病害的目的[15]。PCA分析顯示，移栽前石灰氮的施用使煙株根際土壤微生物群落在旺長期的對(duì)照與處理組中產(chǎn)生明顯差異，進(jìn)入成熟期差異進(jìn)一步增大，而團(tuán)棵期生物菌劑的施用使成熟期煙株根際土壤微生物群落在處理T2，T3中產(chǎn)生差異，煙株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異可能是發(fā)病率產(chǎn)生差別的原因。

旺長期是煙株根際土壤微生物群落變化最明顯的時(shí)期。旺長期根系分泌物增多,土壤內(nèi)各種酶活性增大，微生物活性增加[16]。此時(shí)期的煙株根際土壤中對(duì)照與處理組的Alpha多樣性并沒有顯著差異，但進(jìn)入成熟期后，處理組煙株根際土壤中的物種數(shù)量顯著高于對(duì)照(P<5%)，群落多樣性及群落豐度也明顯高于對(duì)照，且T3的群落豐度也略高于T2。此時(shí)病原菌豐度的差異性檢驗(yàn)顯示，對(duì)照組的病原菌豐度明顯高于處理組，處理T2，T3中病原菌豐度與對(duì)照相比分別降低53%和70%。這表明施用石灰氮及生物菌劑可以增加成熟期的煙株根際土壤的物種種類、物種多樣性及豐富度。有研究顯示，高水平的微生物多樣性能夠抑制土傳病害的發(fā)生，提高土壤質(zhì)量[17-19]。這可能是由于高微生物多樣性可以在一定程度上抑制青枯菌的繁殖，從而達(dá)到防控青枯病的目的。