吳寶婷，王娟，邱雪，朱韻昇，張海紅

(寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

靈武長棗具有質(zhì)脆肉豐、色澤誘人、營養(yǎng)豐富以及鮮食品質(zhì)極佳的特點(diǎn)，是寧夏地區(qū)優(yōu)良的特色鮮食棗種，深受消費(fèi)者歡迎。由于長棗的生理特性，不同成熟度果實(shí)品質(zhì)差異較大，對(duì)應(yīng)的儲(chǔ)藏條件也有所不同，不適當(dāng)?shù)馁A藏會(huì)導(dǎo)致果品過早腐爛變質(zhì)，嚴(yán)重影響和制約了長棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]。果實(shí)硬度是果實(shí)宏觀品質(zhì)中重要的評(píng)價(jià)參數(shù)[2]。果實(shí)硬度隨著果實(shí)成熟過程中細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成(多糖組分、相關(guān)酶)的變化而發(fā)生變化。果實(shí)細(xì)胞壁是維持細(xì)胞形狀、增加細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度、控制細(xì)胞生長和水分運(yùn)輸?shù)闹匾Y(jié)構(gòu)。細(xì)胞壁剛度受到果實(shí)成熟過程中多糖累積程度和細(xì)胞內(nèi)滲透作用的影響[3-4]。目前，關(guān)于果實(shí)微觀力學(xué)的研究方法主要有BLEWETT等[6]的微壓縮方法、HILLER等[7]的微穿刺方法以及ROUTIER等[8]的微壓痕方法。其中，納米微壓痕試驗(yàn)具有樣品要求低以及適用范圍廣的特點(diǎn)，近年來在生命科學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。本研究基于原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)的納米微壓痕試驗(yàn)，通過改變探針的載荷速率，即探針與樣品的作用時(shí)間，獲得不同載荷速率下探針的動(dòng)力學(xué)變化力曲線，從而獲得樣品的楊氏模量。PéREZ等[9]使用原子力顯微鏡研究了蘋果組織在分離細(xì)胞中的楊氏模量分布范圍，結(jié)果表明從蘋果分離得到的細(xì)胞的楊氏模量平均值為(0.63±0.42)MPa，而蘋果組織的楊氏模量為(0.86±0.81)MPa。ZDUNEK等[10]用原子力顯微鏡研究了梨采收前后果實(shí)細(xì)胞壁楊氏模量分布范圍。XIAO等[11]利用原子力顯微鏡對(duì)洋蔥表皮組織細(xì)胞進(jìn)行納米微壓痕試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)果膠和纖維素網(wǎng)絡(luò)對(duì)洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁力學(xué)性質(zhì)影響較大。

本研究分析了不同成熟度的靈武長棗的硬度隨細(xì)胞壁中的多糖(原果膠、可溶性果膠)以及細(xì)胞壁中的果膠甲酯酶(pectin methylesterase，PME)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-Gal)的變化規(guī)律，研究了硬度與細(xì)胞壁楊氏模量之間的關(guān)聯(lián)性，從生物學(xué)和微觀力學(xué)角度解析靈武長棗成熟過程中果實(shí)品質(zhì)變化的原因，為不同成熟度靈武長棗儲(chǔ)藏保鮮提供理論依據(jù)和指導(dǎo)性建議。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試樣品采摘自寧夏靈武市大泉林場(chǎng)棗園，選擇生長狀況良好的同株果樹上的靈武長棗果實(shí)，樹齡為5 a。采收時(shí)間在花后60～65 d，果實(shí)要求外形完好、無病蟲害、無機(jī)械損傷以及大小均一，單果質(zhì)量約20 g。按果實(shí)表面綠色面積占長棗總面積進(jìn)行分級(jí)。當(dāng)綠色面積占棗果總面積的50%定義為50%成熟度，以此類推共分為50%、60%、70%、80%、90%和100%共6種成熟度。根據(jù)分級(jí)要求分為6組進(jìn)行試驗(yàn)，每組10個(gè)樣品，采摘后立即放入低溫冷凍箱內(nèi)進(jìn)行運(yùn)輸，運(yùn)輸過程避免造成機(jī)械損傷[12]。

根據(jù)RENARD等[13]的方法從薄壁組織中分離出醇不溶性殘留物作為細(xì)胞壁材料。將果肉置于無水乙醇中煮沸后冷卻，再與無水乙醇混合后用尼龍過濾器過濾，至苯酚-硫酸法檢測(cè)為陰性后，再將樣品用在質(zhì)量分?jǐn)?shù)96%的乙醇和丙酮混合液中洗滌2次后干燥。

1.2 儀器與設(shè)備

TAXT PLUS/50 物性測(cè)定儀，英國Stable Micro system公司；原子力顯微鏡(PicoPlus) ，美國Agilent公司；Si3N4錐形探針(PSA400彈性系數(shù)0.35 N·m-1)，日本Olympus公司。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 硬度 物性測(cè)定儀在TPA模式下，利用P/2n針狀探頭，在整棗赤道部位均勻取3點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試。設(shè)置測(cè)前速度5 mm·s-1，貫入速度1 mm·s-1，測(cè)后速度5 mm·s-1，最小感知力5 g，穿刺深度5 mm[14]。

1.3.2 可溶性果膠和原果膠測(cè)定 參照曹建康等[15]的方法略加改進(jìn)，取長棗果肉經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇處理后，蒸餾水50 ℃水浴30 min，離心后上清液即為可溶性果膠待測(cè)液。在剩余的沉淀中加入25 mL 0.5 mol·L-1硫酸溶液，沸水浴后離心得到的上清液即為原果膠待測(cè)液。將提取的可溶性果膠和原果膠用咔唑法測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果以生成半乳糖醛酸的質(zhì)量濃度表示。

1.3.3 PME活力測(cè)定 參照LYNGUYEN等[16]的方法用NaOH滴定法測(cè)定酶活力，并略有改動(dòng)。取長棗果肉加入提取緩沖液后冰浴研磨離心，上清液為PME提取液。酶液預(yù)熱后加入果膠，記錄在37 ℃恒溫反應(yīng)時(shí)pH值為7.5消耗的0.1 mol·L-1NaOH的體積，以該條件下1 g鮮質(zhì)量樣品1 min催化果膠釋放羧酸的物質(zhì)的量為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4 PG活力測(cè)定 參照曹建康等[15]的方法并略加改進(jìn)。取長棗果肉加入緩沖液研磨提取，離心后得酶提取液。加入乙酸-乙酸鈉緩沖液和多聚半乳糖醛酸溶液，用DNS比色法測(cè)OD540值，以1 g鮮質(zhì)量樣品在37 ℃下1 h催化多聚半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示。

1.3.5 β-Gal活力測(cè)定 參照GANPUA等[17]的方法。取長棗果肉加入緩沖液冰浴研磨，提取后離心得酶提取液。取酶液加入檸檬酸鹽緩沖液和4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，37 ℃保溫后加Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測(cè)OD400值，以1 g鮮質(zhì)量樣品1 min水解釋放對(duì)硝基苯酚的物質(zhì)的量表示。

1.3.6 細(xì)胞壁材料測(cè)定 在干燥的細(xì)胞壁材料中加入去離子水，得到10 g·L-1的懸浮液滴在顯微鏡載玻片上固定，在測(cè)試前滴加去離子水使樣品膨脹[10]。試驗(yàn)前先使用原子力顯微鏡熱調(diào)諧適配器獲取探針的彈性系數(shù)，不同樣品每次進(jìn)行試驗(yàn)前測(cè)量敏感度，反復(fù)校正5次。將處理好的細(xì)胞壁材料片段置于載物臺(tái)上，將探針移動(dòng)到長棗細(xì)胞壁材料上方，通過輕敲模式，在液體環(huán)境中對(duì)長棗細(xì)胞壁材料進(jìn)行納米微壓痕試驗(yàn)，獲取力-距離曲線。根據(jù)樣品的自身特性，選擇合適的測(cè)試位置。每組樣品隨機(jī)選取10個(gè)片段，得到10 μm×10 μm的掃描結(jié)果，然后在8×8的規(guī)則網(wǎng)格中收集到64個(gè)曲線，每組樣品獲取640條力-距離曲線。測(cè)前探針加載速度3 μm·s-1，測(cè)試探針加載速度為1 μm·s-1，測(cè)后速度3 μm·s-1[18]。錐形探針的Hertz-Sneddon模型滿足以下方程：

(1)

式中：F是探針對(duì)細(xì)胞施加的壓力，E是楊氏模量，v是泊松比，α是探針半開角，δ是壓痕深度。在此試驗(yàn)中選擇泊松比為0.3，α半開角為35°。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Origin 8.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SPSS statistics 22.0軟件在參數(shù)之間進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析以及鄧肯式多重差異分析(P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著)。使用原子力顯微鏡專用的軟件Atomicj得到楊氏模量，獲得的楊氏模量值表示為具有標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度靈武長棗果實(shí)硬度的變化

硬度是反映鮮食果品質(zhì)構(gòu)特性與成熟品質(zhì)的重要指標(biāo)。果實(shí)在成熟過程中，其表觀硬度會(huì)隨果實(shí)內(nèi)部生化代謝過程的進(jìn)行與果實(shí)細(xì)胞壁物質(zhì)的降解而發(fā)生變化，主要體現(xiàn)為細(xì)胞果膠多聚體水解導(dǎo)致的細(xì)胞壁復(fù)雜多糖網(wǎng)絡(luò)的變化。靈武長棗隨成熟度的增加果實(shí)硬度的變化如圖1所示。靈武長棗果實(shí)在成熟過程中，果實(shí)硬度值隨著成熟度的增加逐漸下降，但下降速率隨成熟度的不同而不同。其中，硬度從50%成熟度至70%成熟度下降最快，此后硬度雖繼續(xù)降低但速率有所減緩，至100%成熟度時(shí)，硬度下降為(58.6±15.4)g，相比50%成熟度下的初始硬度，其硬度值下降35.47%(P<0.01)。靈武長棗果實(shí)在成熟過程中硬度下降的原因主要是果膠多聚體水解導(dǎo)致棗果胞壁多糖網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)減弱。

注：不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。下同。Note:There was significant difference (P<0.05) with different letters.The same as below.圖1 不同成熟度靈武長棗果實(shí)硬度的變化Fig.1 Fruit hardness changes of Lingwu long jujube of different maturity

2.2 不同成熟度果實(shí)中細(xì)胞壁組分及相關(guān)酶的變化

2.2.1 不同成熟度果實(shí)中原果膠、可溶性果膠含量的變化 棗果中的原果膠是構(gòu)成細(xì)胞壁架構(gòu)的主要物質(zhì)，對(duì)維持細(xì)胞壁完整性和果實(shí)硬度起著至關(guān)重要的作用，而可溶性果膠是果膠隨成熟度增加的降解產(chǎn)物，在果實(shí)成熟過程中二者共同調(diào)控細(xì)胞壁架構(gòu)體系。由圖2可知，原果膠含量隨著成熟度的增加總體呈下降趨勢(shì)，50%成熟度至60%成熟度原果膠含量下降速率平緩，60%成熟度至90%成熟度原果膠含量則迅速下降。相比50%成熟度，100%成熟度的靈武長棗原果膠含量下降了45.45%(P<0.01)。對(duì)比圖3可知，可溶性果膠含量在成熟過程中與原果膠含量趨勢(shì)并不相同，即50%成熟度至90%成熟度可溶性果膠含量增加速率較快，90%成熟度至100%成熟度可溶性果膠含量增加趨于平穩(wěn)。100%成熟度靈武長棗可溶性果膠含量相比50%成熟度增加了125.37%(P<0.01)。

圖2 不同成熟度下果實(shí)中原果膠含量的變化Fig.2 Variation of the original pectin content of fruits of different maturities

圖3 不同成熟度下果實(shí)中可溶性果膠含量的變化Fig.3 Variation of soluble pectin content of fruits of different maturity

2.2.2 不同成熟度靈武長棗果實(shí)中細(xì)胞壁酶活力的變化 在圖4中，PME活力隨著棗果成熟度的增加總體呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)。80%成熟度時(shí)，PME活力達(dá)到最大值1 170.5 μmol·g-1·min-1，此后雖稍有下降，但相比50%成熟度，100%成熟度PME活力顯著增加至1 049.0 μmol·g-1·min-1。圖5同樣表明，PG活力隨成熟度的增加而顯著增加，相比50%成熟度，100%成熟度PG活力顯著增加了73.68%。從圖6中可以看出，β-Gal活力也隨著成熟度的增加相應(yīng)增加，相比50%成熟度，100%成熟度β-Gal活力增加了113.11%。

圖4 不同成熟度下果實(shí)中PME活力的變化Fig.4 Changes in PME activity in fruits of different maturities

圖5 不同成熟度下果實(shí)中PG活力的變化Fig.5 Changes in PG activity in fruits of different maturities

圖6 不同成熟度果實(shí)中β-Gal活力的變化Fig.6 Changes in β-Gal activity in fruits of different maturity

2.3 不同成熟度靈武長棗果實(shí)中細(xì)胞壁楊氏模量的變化

隨著靈武長棗成熟度的增加，果實(shí)宏觀質(zhì)構(gòu)特性主要表現(xiàn)為果實(shí)硬度的變化，而楊氏模量則可作為其內(nèi)部微觀力學(xué)特性變化的體現(xiàn)。從圖7中可以看出不同成熟度果實(shí)的楊氏模量分布特點(diǎn)。不同成熟度楊氏模量值主要分布在0～60 kPa。50%成熟度果實(shí)細(xì)胞壁楊氏模量主要分布在0～50 kPa，在30～40 kPa分布最多。60%成熟度果實(shí)細(xì)胞壁楊氏模量分布在0～20 kPa最多，擬合曲線峰值在40～45 kPa，且在100～200 kPa之間仍有較多分布。70%成熟度果實(shí)細(xì)胞壁楊氏模量主要分布在0～40 kPa，尤其在10～15 kPa范圍內(nèi)，這也就是70%成熟度平均楊氏模量值最小的原因。在80%成熟度果實(shí)的頻率直方圖中擬合曲線波峰在50～60 kPa，分布在60 kPa以上也很多，使得其楊氏模量平均值最大。90%成熟度果實(shí)細(xì)胞壁楊氏模量主要分布在0～60 kPa，在60～160 kPa區(qū)間也有較多分布。100%成熟度果實(shí)細(xì)胞壁楊氏模量主要分布在0～50 kPa，大于50 kPa的數(shù)據(jù)只占5%左右，降低了其楊氏模量平均值。擬合曲線波峰從50%成熟度到60%成熟度先有所后移，在70%成熟度又前移，到80%成熟度又變高且后移，至90%成熟度時(shí)變得平緩，最后在100%成熟度時(shí)變尖且繼續(xù)前移。

注：A、B、C、D、E、F分別為50%、60%、70%、80%、90%、100%成熟度。Note：A,B,C,D,E,F,means 50%,60%,70%,80%,90%,and 100% maturity of the ripe fruit,respectively.圖7 不同成熟度果實(shí)的楊氏模量分布頻率直方圖Fig.7 Histogram of Young’s modulus distribution frequency of fruits of different maturity

圖8為靈武長棗生長過程中，隨著成熟度增加其對(duì)應(yīng)楊氏模量的變化情況。不同成熟度之間的楊氏模量分布范圍差別較大，且經(jīng)高斯擬合計(jì)算后，各成熟度下的楊氏模量范圍均呈偏正態(tài)分布。其中，50%、60%、70%、80%、90%和100%成熟度的平均楊氏模量分別為(35.38±17.56)、(41.49±16.52)、(23.27±21.35)、(51.83±23.53)、(43.93±15.34)、(22.59±17.19) kPa。80%成熟度與100%成熟度的平均楊氏模量呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；60%成熟度與90%成熟度的平均楊氏模量之間差異不顯著(P>0.05)，70%成熟度與100%成熟度的平均楊氏模量差異不顯著(P>0.05)。該結(jié)果表明不同成熟度下的平均楊氏模量差異較大。

圖8 不同成熟度果實(shí)的楊氏模量分布箱型圖Fig.8 Box diagram of Young’s modulus distribution of fruits of different maturity

2.4 果實(shí)硬度、細(xì)胞壁楊氏模量、細(xì)胞壁組分及其相關(guān)酶之間的相關(guān)性

表1為靈武長棗成熟過程中硬度、細(xì)胞壁楊氏模量、細(xì)胞壁組分及其相關(guān)酶之間的相關(guān)性。成熟度與硬度、原果膠含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到-0.984、-0.971；與可溶性果膠、PG和β-Gal之間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.987、0.984、0.993；與PME呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.812；但成熟度與楊氏模量之間缺乏直接相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)僅為-0.128。靈武長棗成熟過程中果實(shí)硬度、細(xì)胞壁組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其降解酶活力之間密切相關(guān)。硬度與原果膠、可溶性果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.931、-0.974，與果實(shí)的PG、PME和β-Gal之間呈相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到-0.986、-0.863、-0.990。但果實(shí)的細(xì)胞壁楊氏模量與硬度、原果膠、可溶性果膠質(zhì)量、PG、PME和β-Gal之間均缺乏直接相關(guān)性。

表1 果實(shí)硬度、細(xì)胞壁楊氏模量、細(xì)胞組分及其相關(guān)酶之間的相關(guān)性Table 1 Correlation between fruit hardness,cell wall Young’s modulus,cell components and their related enzymes

3 結(jié)論與討論

本研究從生物學(xué)及微觀力學(xué)角度對(duì)靈武長棗宏觀硬度隨成熟度的變化進(jìn)行了分析。研究結(jié)果表明，靈武長棗成熟過程中其硬度變化是細(xì)胞壁組分變化造成的，與參與果實(shí)成熟代謝酶密切相關(guān)。隨著成熟度的增大，靈武長棗果實(shí)硬度不斷降低，推測(cè)是因?yàn)槌墒斐跗诘墓麑?shí)內(nèi)部生命活動(dòng)較為旺盛，伴隨著內(nèi)部干物質(zhì)的大量生成積累，在生長素和細(xì)胞分裂素的共同作用下，細(xì)胞數(shù)量增加較快，果實(shí)體積快速增長膨大，果實(shí)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從緊密逐漸松散，硬度下降較快[19]。此后，果實(shí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)隨著果實(shí)成熟度的增加逐漸趨于穩(wěn)定，細(xì)胞數(shù)量變化不大，硬度的下降主要是細(xì)胞代謝及果實(shí)內(nèi)部降解酶系對(duì)果實(shí)細(xì)胞壁果膠物質(zhì)的增溶解聚及中膠層、中性側(cè)鏈的共同降解作用所致，故果實(shí)硬度下降有所減緩[20]。原果膠含量降低，可溶性果膠含量增加，這是由于棗果在成熟過程中，原果膠在PME的作用下進(jìn)行去酯化，同時(shí)PG的酶活力增強(qiáng)使得果膠鏈進(jìn)一步解聚，長鏈縮短，故其原果膠含量隨成熟度增加呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，隨著原果膠降解程度的增加，使得內(nèi)部果膠短鏈含量增加，可溶性果膠含量進(jìn)一步增加。原果膠由于其致密結(jié)構(gòu)，初始含量高，故果實(shí)硬度較大。隨著果實(shí)成熟的進(jìn)行，果膠的降解會(huì)增加細(xì)胞壁交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)孔大小，導(dǎo)致軟化后期細(xì)胞壁膨脹,使底物更容易受到酶的作用，進(jìn)而導(dǎo)致果實(shí)硬度下降[21]。

PME和PG是棗果生長發(fā)育中調(diào)控其成熟軟化的重要酶類，均對(duì)采后果實(shí)軟化及硬度下降起著關(guān)鍵作用。由于PG隱藏在細(xì)胞壁內(nèi)，并且高度甲酯化，在去酯化作用后才能發(fā)揮PG的水解作用。PME主要使果膠去甲酯化，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，破壞多聚糖醛酸鏈間鈣的橫向聯(lián)接而導(dǎo)致細(xì)胞分離，同時(shí)生成適合于PG作用的底物，在共同作用下果膠降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)松散，果實(shí)軟化[22]。β-Gal的作用主要是切斷細(xì)胞壁物質(zhì)的半乳糖苷鍵，清除半乳糖殘基，并作用于果膠多糖的側(cè)鏈，使果膠網(wǎng)絡(luò)松動(dòng)，細(xì)胞間隙增大，有利于與其他果膠酶與底物的接觸[23]，增加了與棗果硬度相關(guān)的底物的降解。

細(xì)胞壁降解酶水解細(xì)胞壁多糖，使細(xì)胞間連接減少，導(dǎo)致細(xì)胞離散，且這些酶在果實(shí)軟化的不同階段起不同的作用。該研究結(jié)果有助于深入研究不同成熟度靈武長棗果實(shí)的酶學(xué)調(diào)控機(jī)制，為靈武長棗的保鮮儲(chǔ)藏提供科學(xué)依據(jù)。在果實(shí)成熟過程中PME、PG、β-Gal對(duì)果膠的降解具有協(xié)同效應(yīng)，隨著棗果成熟度的增加，上述細(xì)胞壁降解酶系活力隨之增加并共同作用于棗果果膠鏈的降解和溶解，啟動(dòng)了靈武長棗果實(shí)的軟化進(jìn)程，進(jìn)而造成果實(shí)硬度下降。這與李歡等[24]對(duì)棗成熟軟化機(jī)理的研究一致。另外，成熟過程中果實(shí)的宏觀硬度與細(xì)胞壁楊氏模量之間相關(guān)性不顯著，相關(guān)系數(shù)僅為0.129(P<0.01)，推測(cè)是在靈武長棗果實(shí)成熟過程中，與硬度下降有關(guān)的因素較多，相關(guān)參數(shù)之間差異過大，導(dǎo)致細(xì)胞壁剛度對(duì)果實(shí)硬度的作用被果實(shí)組織力學(xué)模型的其他參數(shù)所掩蓋。楊氏模量與細(xì)胞微觀力學(xué)參數(shù)之間并不存在絕對(duì)相關(guān)性。邱雪等[25]研究表明，靜壓損傷棗果與撞擊損傷棗果的細(xì)胞壁楊氏模量值之間無顯著差異。本研究推測(cè)在成熟過程中不同因素包括外部損傷等都會(huì)導(dǎo)致棗果之間細(xì)胞微觀力學(xué)發(fā)生變化。