趙順鑫，周 濃,，楊琳琳，魏祖晨，谷文超，陳妍斌，陳群輝，吳應(yīng)梅*

(1. 重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，重慶 404120； 2. 大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671000)

浙貝母為百合科植物浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鱗莖，具有清熱化痰止咳，解毒散結(jié)消癰的功效，可用于風(fēng)熱咳嗽，痰火咳嗽，肺癰，乳癰，瘰疬，瘡毒的治療[1]。有研究表明浙貝母提取物可對(duì)H1N1流感病毒發(fā)揮抗病毒作用，具有作為新型候選治療藥物或抗流感劑的潛在用途[2]。化學(xué)研究表明浙貝母的主要活性成分是生物堿、皂苷類、水溶性成分等[3-4]，而水溶性成分主要為核苷類化合物[5]，是貝母質(zhì)量控制與檢測(cè)的主要指標(biāo)之一[6-7]。浙貝母的產(chǎn)地較多，在現(xiàn)有的研究中有學(xué)者以生物堿為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)浙貝母的地理差異性進(jìn)行了研究[8]，但以核苷類成分為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的地理差異性研究較少。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)不同產(chǎn)地浙貝母藥材中10種水溶性核苷類成分進(jìn)行分析，并對(duì)比不同產(chǎn)地栽培前后核苷類化合物的含量變化，以期為浙貝母的質(zhì)量控制及浙貝母藥材的栽培和開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(LC-20A，日本島津公司)；超聲波清洗機(jī)(SB-5200DTN，寧波新芝生物科技股份有限公司)；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(TDZ5-WS，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；萬分之一分析天平(CP225D，德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 試驗(yàn)藥材與試劑

浙貝母樣品來源于浙江省磐安縣、浙江省寧波市、江蘇省南通市和重慶市奉節(jié)縣4個(gè)種植基地，經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為百合科植物浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鱗莖(見表1)。

表1 樣品來源Table 1 Samples source

對(duì)照品尿嘧啶(CAS: 66-22-8)、胞苷(CAS: 65-46-3)、鳥嘌呤(CAS: 73-40-5)、鳥苷(CAS: 118-00-3)、腺嘌呤(CAS: 73-24-5)、尿苷(CAS: 58-96-8)、脫氧肌苷(CAS: 890-38-0)、脫氧胸苷(CAS: 50-89-5)、腺苷(CAS: 58-61-7)和脫氧腺苷(CAS: 16373-93-6)購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司，純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計(jì)算大于98%。甲醇為德國(guó)默克公司生產(chǎn)的色譜純甲醇，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Venusil MP C18(2)柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A(水)-B(甲醇)梯度洗脫：0～15 min(B 1%～5%)；15～20 min(B 5%～15%)；20～25 min(B 15%～20%)；25～33 min(B 20%～28%)。檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃。按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各成分分離度良好，混合對(duì)照品和浙貝母藥材(S2)色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)及樣品(B)的HPLC圖譜Fig.1 The Chromatogram of reference substances (A) and Sample (B)注：1 尿嘧啶；2 胞苷；3 鳥嘌呤；4 鳥苷；5 腺嘌呤；6 尿苷；7 脫氧肌苷；8 脫氧胸苷；9 腺苷；10 脫氧腺苷

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧胸苷、腺苷、脫氧腺苷對(duì)照品適量，加蒸餾水溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.532、0.768、0.174、0.844、0.575、0.570、0.643、0.485、0.564、0.512 mg·mL-1的對(duì)照品貯備液。

2.3 樣品溶液的制備

精密稱取浙貝母粉末(過50目篩)1.0 g，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加20%甲醇10 mL，混勻，室溫下超聲提取30 min(超聲功率300 W，工作頻率40 kHz)，取出，放至室溫，搖勻，倒入離心管中，4 000 r·min-1離心10 min，過濾，濾渣重復(fù)上述操作1次，合并濾液，以20%甲醇定容至25 mL容量瓶中，上機(jī)前4 000 r·min-1離心10 min后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取2.2項(xiàng)下各對(duì)照品貯備液適量，加蒸餾水定容至10 mL制成混合對(duì)照品溶液，尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧胸苷、腺苷、脫氧腺苷的質(zhì)量濃度分別為26.600、57.600、13.050、50.640、25.875、34.200、67.515、43.650、59.220、30.720 μg·mL-1。并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的10種核苷混合對(duì)照品溶液，置于4℃的冰箱內(nèi)，臨用前以0.22 μm微孔濾膜濾過，供分析用。分別在2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，以各對(duì)照品的峰面積積分值(y)與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 對(duì)照品的線性關(guān)系和范圍Table 2 Linearities and ranges of ten reference substances

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取2.4項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各核苷的色譜峰面積，通過計(jì)算RSD以考察儀器的精密度。結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧胸苷、腺苷、脫氧腺苷峰面積的RSD分別是0.22%，0.74%，1.74%，0.18%，0.12%，0.20%，0.86%，0.12%，0.44%，0.28%，表明本方法精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一浙貝母樣品6份(S1)，每份精密稱定1.0 g，按照2.3項(xiàng)方法平行制備樣品溶液，按照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，記錄各核苷的色譜峰面積，通過計(jì)算RSD以考察本方法的重復(fù)性。結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧胸苷、腺苷、脫氧腺苷峰面積的RSD分別是1.22%，2.46%，1.99%，1.46%，1.54%，2.54%，2.23%，2.21%，1.97%，2.35%，表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將制成的樣品溶液(S2)在室溫條件下密閉放置，分別在0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣6次，記錄各核苷的色譜峰面積，通過計(jì)算RSD以考察本樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧胸苷、腺苷、脫氧腺苷峰面積的RSD分別是1.43%，2.31%，2.68%，2.36%，2.71%，1.21%，1.35%，1.69%，2.70%，2.44%，表明樣品溶液9 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知含量的浙貝母粉末0.5 g(S2)，共6份，分別精密依次加入2.2項(xiàng)下各核苷對(duì)照品貯備溶液適量，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，計(jì)算各成分的加樣回收率和RSD，用于驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，浙貝母(S2)中10種核苷的平均回收率在97.52%～102.99%，RSD范圍為1.35%～2.41%，符合分析要求。表明上述實(shí)驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度較高，能應(yīng)用于浙貝母中核苷類活性成分的檢測(cè)與分析。

表3 浙貝母中10種核苷類成分的加樣回收率試驗(yàn)(n=6)Table 3 Recovery test of 10 nucleoside components in F. thunbergii Miq.

2.6 樣品含量測(cè)定

按2.3項(xiàng)下方法制備8批供試品溶液，每組平行準(zhǔn)備3份，按2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定浙貝母中10種核苷類化合物的含量。不同樣品中核苷類成分含量結(jié)果見表4。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地浙貝母中10種核苷類成分含量差異顯著，每個(gè)樣品10種核苷類成分結(jié)構(gòu)比(每個(gè)核苷類成分所占該樣品核苷類成分總量比值)不相同。4個(gè)產(chǎn)地的浙貝母中尿嘧啶、胞苷、鳥嘌呤、鳥苷、腺嘌呤、尿苷、脫氧肌苷、脫氧胸苷、腺苷、脫氧腺苷和核苷總平均含量分別為120.593、134.784、90.914、244.528、80.545、383.489、320.191、119.870、275.248、73.203、1843.365 μg·g-1。其中，尿苷含量最高，平均含量達(dá)383.489 μg·g-1，鳥苷、尿苷、脫氧肌苷和腺苷的平均含量占10種核苷類化合物平均總量的66%，而鳥嘌呤、腺嘌呤、脫氧腺苷含量相對(duì)較低，占核苷總量的13%。浙江省磐安縣(S1、S2)和江蘇省南通市(S5、S6)兩個(gè)產(chǎn)地的樣品中10種核苷類化合物栽培前后的總量均高于其他兩個(gè)產(chǎn)地。栽培前后相比較，除浙江寧波產(chǎn)地外，其他產(chǎn)地浙貝母栽培后胞苷含量高于栽培前，4產(chǎn)地浙貝母樣品栽培后核苷類成分(胞苷除外)含量及核苷總量均小于栽培前。

2.7 相關(guān)性分析

為了找出10種核苷類成分之間的聯(lián)系，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)浙貝母的10種核苷成分進(jìn)行線性回歸分析，保留因素P<0.05，發(fā)現(xiàn)各成分之間存在關(guān)聯(lián)性。具體線性回歸方程如下：

尿嘧啶=-1169.641+3.511×胞苷-4.710×鳥嘌呤+2.874×鳥苷+0.849×尿苷-1.211×脫氧肌苷+2.716×腺苷-1.955×脫氧腺苷

胞苷=333.089+0.285×尿嘧啶+1.341×鳥嘌呤-0.818×鳥苷-0.242×尿苷+0.345×脫氧肌苷-0.774×腺苷+0.557×脫氧腺苷

鳥嘌呤=-248.326-0.212×尿嘧啶+0.610×鳥苷+0.180×尿苷-0.257×脫氧肌苷+0.577×腺苷-0.415×脫氧腺苷+0.746×胞苷

鳥苷=406.974+0.348×尿嘧啶-1.222×胞苷+1.639×鳥嘌呤-0.296×尿苷+0.422×脫氧肌苷-0.945×腺苷+0.680×脫氧腺苷

腺嘌呤=-70.539+0.169×尿嘧啶+0.334×鳥嘌呤+0.141×尿苷+0.276×脫氧肌苷+0.017×鳥苷-0.244×腺苷+0.286×脫氧腺苷

尿苷=808.827-0.365×尿嘧啶-1.453×胞苷+0.410×鳥嘌呤-0.770×脫氧肌苷-0.506×脫氧腺苷-1.268×鳥苷+4.606×腺嘌呤

脫氧肌苷=698.692-0.400×尿嘧啶-1.025×胞苷-0.916×脫氧胸苷+0.363×腺苷-0.643×鳥苷+4.519×腺嘌呤-1.014×尿苷

脫氧胸苷=220.925-0.780×尿嘧啶-0.337×胞苷+0.247×鳥嘌呤+0.827×脫氧腺苷+0.237×鳥苷-0.160×尿苷-0.090×脫氧肌苷

腺苷=372.434+0.281×尿嘧啶-1.228×胞苷+1.519×鳥嘌呤-1.265×鳥苷-0.174×尿苷+0.525×脫氧肌苷+0.870×脫氧胸苷

脫氧腺苷=-53.724-0.101×尿嘧啶-0.189×鳥嘌呤-0.379×鳥苷+0.180×尿苷+0.147×脫氧肌苷+1.272×脫氧胸苷-0.073×腺苷

表4 不同產(chǎn)地栽前栽后浙貝母藥材中10種核苷類成分的含量(μg·g-1，n=3)Table 4 The content of 10 nucleoside components of F. thunbergii Miq. sample before and after planting in different regions

2.8 主成分分析

應(yīng)用SPSS分析軟件對(duì)所有樣品中10種核苷類成分含量進(jìn)行主成分分析。提取標(biāo)準(zhǔn)為特征值大于1,得到3個(gè)主成分,累積貢獻(xiàn)率達(dá)到86.10%。其中,第一主成分λ=4.171,方差貢獻(xiàn)率為41.71%,包含的信息量大, 貢獻(xiàn)率最高。第二主成分λ=2.411,方差貢獻(xiàn)率為24.11%。第三主成分λ=2.028,方差貢獻(xiàn)率為20.28%。主成分得分系數(shù)矩陣見表5。由表5可知，主成分1與尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、脫氧胸苷和脫氧腺苷5個(gè)成分的相關(guān)性高于其他核苷類成分，相關(guān)系數(shù)在0.186～0.198之間。

將SPSS軟件給出的主成分得分系數(shù)乘以主成分相對(duì)應(yīng)的特征值的平方根,便得到3個(gè)主成分中每個(gè)指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的系數(shù),關(guān)系式如下:F1=0.386X尿嘧啶-0.112X胞苷+0.380X腺嘌呤+0.380X尿苷+0.319X腺苷+0.241X鳥嘌呤+0.268X鳥苷-0.067X脫氧肌苷+0.390X脫氧胸苷+0.404X脫氧腺苷；F2=-0.253X尿嘧啶+0.446X胞苷+0.371X腺嘌呤+0.244X尿苷-0.157X腺苷+0.533X鳥嘌呤+0.245X鳥苷+0.102X脫氧肌苷-0.252X脫氧胸苷-0.311X脫氧腺苷；F3=-0.269X尿嘧啶-0.394X胞苷+0.081X腺嘌呤+0.179X尿苷+0.471X腺苷+0.011X鳥嘌呤-0.150X鳥苷+0.654X脫氧肌苷-0.246X脫氧胸苷-0.030X脫氧腺苷。

表5 8批樣品中主成分得分系數(shù)矩陣Table 5 Principal component score coefficient matrix in 8 batches of samples

3 討論

核苷類化合物主要包括核苷、核苷堿基及相關(guān)衍生物，是許多抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，具有多種生物學(xué)活性[9-10]。中藥材的核苷類成分檢測(cè)方法主要為HPLC法，具有操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)。相關(guān)研究表明，對(duì)于不同藥材中核苷類物質(zhì)的測(cè)定，HPLC的流動(dòng)相使用有所不同。陳啟宏等[11]采用HPLC法以1%冰醋酸-甲醇為流動(dòng)相準(zhǔn)確測(cè)定了斑蝥中尿嘧啶、尿嘧啶核苷、次黃嘌呤3種核苷類成分。夏成凱等[12]采用HPLC法以乙腈-水為流動(dòng)相準(zhǔn)確測(cè)定了半夏及其偽品中尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷4種核苷類成分。周恒等[13]采用HPLC法以乙酸銨-甲醇為流動(dòng)相準(zhǔn)確測(cè)定了滬地龍中包括尿苷、肌苷、鳥苷等7種核苷類成分。本研究中采用甲醇-水體系作為流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地浙貝母中的10種核苷類化合物，其方法學(xué)考察均符合要求，適用于浙貝母藥材中核苷類物質(zhì)的測(cè)定。

本研究對(duì)4個(gè)產(chǎn)地浙貝母藥材中10種核苷類化合物測(cè)定結(jié)果顯示：4個(gè)產(chǎn)地的浙貝母樣品中均檢測(cè)出10種成分的存在，表明不同產(chǎn)地浙貝母的核苷類成分較為相似，但不同產(chǎn)地各核苷成分所占其核苷類成分總量比例不同，核苷組成比例因產(chǎn)地不同存在差異。據(jù)報(bào)道，不同的核苷組成比例對(duì)免疫系統(tǒng)具有不同的作用[14-15]，說明各核苷類成分之間的含量比與藥效具有相關(guān)性。推測(cè)這種組成含量差異是造成浙貝母藥效差異的主要原因。在主成分分析中，第一主成分F1與除胞苷及脫氧肌苷外8種核苷類成分均呈正相關(guān)，其中與尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、脫氧胸苷和脫氧腺苷的正相關(guān)性較強(qiáng)，且主成分1貢獻(xiàn)率最大，達(dá)41.71%，說明尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、脫氧胸苷和脫氧腺苷5個(gè)成分在浙貝母中核苷類成分的質(zhì)量控制方面具有重要作用。

比較4個(gè)產(chǎn)地浙貝母栽培前后10種核苷類化合物含量，發(fā)現(xiàn)與栽培前相比，除胞苷含量在栽培后增多，其余核苷含量均不同程度降低，栽培后10種核苷類化合物的總量均小于栽培前。原因可能是浙貝母生長(zhǎng)過程中土壤肥力不足，生長(zhǎng)期未及時(shí)追肥所致[16]。栽培前4個(gè)產(chǎn)地核苷總量大小為：S1>S5>S3>S7，而栽培后則為：S6>S2>S4>S8，可以看出，浙江省磐安縣(S1、S2)與江蘇省南通市(S5、S6)產(chǎn)地浙貝母在栽培前后核苷總量均高于其它兩個(gè)產(chǎn)地，可做為優(yōu)質(zhì)種源產(chǎn)地。核苷類化合物已被證實(shí)是浙貝母中重要的生物活性物質(zhì)，與浙貝母藥效(抗炎、祛痰等)具有一定的關(guān)聯(lián)性[17]。其中，胞苷不僅是很多抗病毒、抗腫瘤和抗艾滋病藥物的良好中間體,也是基因工程研究的重要原材料[18]。因此建議在浙貝母栽培過程中適當(dāng)使用含有核苷酸鹽成分的營(yíng)養(yǎng)素為其補(bǔ)充養(yǎng)分，以保持浙貝母有效藥用成分的含量。

本研究建立了HPLC測(cè)定浙貝母10種核苷類成分含量的方法，該方法靈敏度高，分離效果好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。同時(shí)比較了4個(gè)不同產(chǎn)地浙貝母栽培前與栽培后核苷類物質(zhì)的含量差異，為浙貝母質(zhì)量評(píng)價(jià)，品種選育提供參考。