陳俊磊，成 禮，胡恩明，姜陽明，黃烈軍，張嘉瑜，楊小生，顧 瑋*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥用植物資源功效利用與開發(fā)國家重點實驗室，貴州 貴陽 550014； 2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550014)

無籽刺梨(Rosasterilis)又名無子刺梨、金刺梨、或塔鉤刺梨，為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)多年生灌木，1985年時圣德將其作為新分類群發(fā)表，為貴州省特有品種[1]。由于無籽刺梨相比貴州傳統(tǒng)水果刺梨——繅絲花(R.roxburghiix)的果實具有明顯的優(yōu)勢，其果肉更加細(xì)膩，口感酸甜，并無刺梨的酸澀之味，更適合作為水果直接食用等特點，目前在貴州省安順市和黔西南州有廣泛的引種栽培與開發(fā)[2-5]。無籽刺梨發(fā)育過程不產(chǎn)生種子或者種子敗育，只能依賴無性繁殖[6]。野生薔薇屬植物的自然雜交能力已經(jīng)被很多實驗以及園藝品種培育的實踐證明[7]。學(xué)界認(rèn)為無籽刺梨可能為一個自然雜交種，其并不能劃分為一個獨立的種，目前未被中國植物志收錄。關(guān)于其雜交起源或者親緣，近年來開展了一些相關(guān)研究。李旦等[8]利用AFLP分子標(biāo)記和DNA條形碼技術(shù)，對采自貴州省興仁縣和貴州省安順市的刺梨、無籽刺梨和光枝無籽刺梨(R.sterilisvar.leioclada)共19份樣本材料進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明無籽刺梨與刺梨是獨立的2個種，興仁縣無籽刺梨與安順市的光枝無籽刺梨為同一個種。鄧亨寧等[9]分析了薔薇屬植物15種、2個變種和2個變型的5個葉綠體基因片段(psb-trnH、trnL-trnF、trnK-matK、psbI-psbK和rpoC1)和2個核基因片段(ITS和GAPDH)，推測無籽刺梨起源于長尖葉薔薇(R.longicuspis)與繅絲花的天然雜交，長尖葉薔薇為母本，繅絲花為父本。而文曉鵬等[10]基于形態(tài)學(xué)和RAPD分析，認(rèn)為無籽刺梨很可能來源于貴州繅絲花(R.kweichowensis)的高度雄性不育變異，和繅絲花有明顯差別，不可聚為一類。陳興銀等[11]對采自貴州興仁的無籽刺梨、貴州安順的光枝無籽刺梨以及采自貴州遵義、興仁的繅絲花和從NCBI網(wǎng)站下載的長尖葉薔薇進(jìn)行了ITS序列分析，結(jié)果顯示無籽刺梨與長尖葉薔薇聚為一支。綜合前人的研究結(jié)果來看，無籽刺梨的真正起源仍舊缺乏足夠證據(jù)。

肖培根等提出的藥用植物親緣學(xué)從理論上總結(jié)藥用植物的生物親緣關(guān)系、化學(xué)成分和療效間的相關(guān)性[12-14]。植物次生代謝產(chǎn)物是其發(fā)揮藥用功效的主要成分，不同類群植物次生代謝產(chǎn)物有明顯的差異性，根據(jù)植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的異同也可以作為植物分類的標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究基于植物化學(xué)分類學(xué)的理論，采用HPLC指紋圖譜進(jìn)行相似度分析和聚類分析，根據(jù)其化學(xué)圖譜的特征探討無籽刺梨的親緣關(guān)系及分類問題，以期為其基原鑒別和質(zhì)量評價提供新的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent科技有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(HWS24，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；多功能粉碎機(jī)(2500Y，永康市鉑歐五金制品有限公司)；萬分之一電子分析天平(ME104E，梅特勒-托利多國際貿(mào)易上海有限公司)；超聲清洗器(KQ5200，昆山市超聲儀器有限公司)；臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELA N-1100，日本東京理化器械株式會社)。

1.2 材料與試劑

純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；甲醇色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；甲酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；95%乙醇(重慶萬盛川東化工有限公司)。

無籽刺梨材料采自安順市西秀區(qū)無籽刺梨種植基地，其余10種野生薔薇屬植物材料采集自貴陽周邊以及安順、興義、雷山等地，標(biāo)本由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室顧瑋副研究員鑒定，植物拉丁學(xué)名參考《中國植物志》全文電子版[15]，植物標(biāo)本(2019-Z-10)存放于貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室。具體材料來源信息如表1所示。

表1 薔薇屬植物的來源Table 1 Sources of Rosa plants

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

取藥材粉末50 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入5倍劑量80%乙醇回流提取2次，每次4 h，補(bǔ)足失重，搖勻，過濾，合并兩次濾液，回收乙醇至無醇味。濃縮液依次用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取5次(每次75 mL)。其中乙酸乙酯萃取液經(jīng)減壓濃縮至干燥后，得脂溶性部位。取該部位150 mg，精密稱定，加入甲醇溶解并定容至5 mL，超聲處理15 min，放冷，搖勻。取供試品溶液適量，離心后取上清液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.3.2 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-0.02%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫(0～45 min，13%A；45～50 min，13%～15%A；50～90 min，15%A；90～120 min，15%～25%A；120～160 min，25%A；160～170 min，25%～30%A；170～200 min，30%A；200～220 min，30%～40%A；220～250 min，40%～55%A，250～255 min，55%～70%A)；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量3 μL；檢測波長268 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密性試驗

取無籽刺梨供試品溶液，按1.3.2項所述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。選取60號峰為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，分別為0.02%～0.43%和0.68%～3.39%；利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件計算其相似度均為100%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗

取無籽刺梨供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、25 h按1.3.2項所述色譜條件進(jìn)樣。選取60號峰為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，分別為0.03%～0.53%和0.58%～4.39%；利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件計算其相似度均為100%。結(jié)果表明供試品溶液25 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重現(xiàn)性試驗

取無籽刺梨粉末6份，精密稱定，分別按照1.3.1項下方法制備供試品溶液，按1.3.2項所述色譜條件進(jìn)樣。選取60號峰為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD，分別為0.01%～0.68%和0.55%～3.57%；利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件計算其相似度均為100%。結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2 指紋圖譜的建立及分析

2.2.1 指紋圖譜共有模式的建立

取S1～S11粉碎的藥材，按1.3.1項制備供試品溶液，按1.3.2項色譜條件進(jìn)行分析，記錄各個樣品的HPLC色譜圖。將其原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會開發(fā)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件，以無籽刺梨為對照譜圖，對保留時間5～255 min的色譜峰進(jìn)行多點校正后，自動匹配，得到11種薔薇屬植物脂溶性部位HPLC指紋圖譜疊加圖，如圖1所示。

圖1 11種薔薇屬植物脂溶性部位HPLC指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprints of liposoluble parts from 11 Rosa species

2.2.2 相似度評價

由無籽刺梨的HPLC色譜圖可知，共識別出93個單峰，占其總峰面積的94%。以無籽刺梨的93個單峰為參考，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件，以時間寬度為0.5 min進(jìn)行峰匹配，確定11種薔薇屬植物有29個共有峰，分別為1、7、8、13、15、23、26、28、30、32～35、37、39、43、48、56、59、60、62、67、70、72、75、86、90、92及93。選取60號峰為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和RSD，如表2所示。

表2 共有峰相對保留時間Table 2 Relative retention times of common peaks

同時，通過保留時間比較發(fā)現(xiàn)，無籽刺梨分別與繅絲花、長尖葉薔薇、復(fù)傘房薔薇、懸鉤子薔薇、軟條七薔薇、擬木香、鈍葉薔薇、小果薔薇、單瓣白木香及金櫻子的共有峰數(shù)為69、75、65、62、67、66、63、63、67及59，分別為其單峰數(shù)的74.2%、80.6%、69.9%、66.7%、72%、71%、67.8%、67.8%、72%及63.4%。其中長尖葉薔薇、繅絲花和無籽刺梨的共有峰最多，與無籽刺梨化合物數(shù)量相似度分別為80.6%和74.2%。此外，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件計算無籽刺梨和10種薔薇屬植物的相似度，如表3所示。

表3 相似度對照表Table 3 Similarity comparison

2.2.3 聚類分析

采用SPSS 25.0軟件，以無籽刺梨的93個單峰，以及與10種薔薇屬植物的共有峰面積為變量(若無共有峰，則該峰面積為0)，得到11×93矩陣，先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后采用瓦爾德聯(lián)接法，利用歐氏距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，Z值得分標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，當(dāng)歐氏距離為10時，可將11種薔薇屬植物脂溶性部位大致分為4類：無籽刺梨、長尖葉薔薇及小果薔薇聚為一類，復(fù)傘房薔薇、懸鉤子薔薇、軟條七薔薇、擬木香、鈍葉薔薇及單瓣白木香聚為一類；繅絲花及金櫻子各自為一類。

圖2 聚類分析結(jié)果Fig. 2 Result of clustering analysis

3 結(jié)論與討論

3.1 條件優(yōu)化

本研究采用全波長掃描200～400 nm內(nèi)的PDA掃描圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在268 nm下色譜信息最豐富，各色譜分離相對較好、基線平穩(wěn)，信息量大，故選擇268 nm作為檢測波長；由于絕大多數(shù)藥用植物中的有效成分屬于次生代謝產(chǎn)物，且較為復(fù)雜，因此使用單一流動相很難達(dá)到較好的分離效果。本研究選擇甲醇-0.02%甲酸水溶液體系作為流動相，采用梯度洗脫程序，同時為了盡量識別出樣品的每個色譜峰，也結(jié)合了等度洗脫的程序。加入甲酸調(diào)pH是為了改善色譜峰的分離程度及峰形。此外，結(jié)合文獻(xiàn)[16]方法并加以修改對上述條件進(jìn)行方法學(xué)考察，其精密型、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性試驗中所得RSD值均小于5%，符合HPLC指紋圖譜的要求，表明該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性較好。

3.2 綜合分析方法的探討

對于建立HPLC指紋圖譜的方法，相關(guān)研究多數(shù)采用選取某一樣品作為參照譜圖，進(jìn)行多點校正和自動匹配后生成對照指紋圖譜，而后利用其共有成分進(jìn)行聚類分析、主成分分析、偏最小二乘法判別等，廣泛用于同種植物在不同產(chǎn)地、季節(jié)或批次等的品質(zhì)鑒定、質(zhì)量控制及親緣關(guān)系[17-20]。然而，利用所有樣品共有成分進(jìn)行綜合分析，這對研究無籽刺梨與薔薇屬植物間的化學(xué)親緣關(guān)系似乎不太合理，因為選取的共有成分進(jìn)行綜合分析，可能會忽略無籽刺梨與同屬的一個或多個植物的共有信息。因此，為了確保這些信息能有效參與分析，本研究借鑒秦華珍[21]和蘇善美[22]等的研究思路并結(jié)合聚類分析加以修改，以無籽刺梨為參照譜圖，其它10種薔薇屬植物與該參照譜圖進(jìn)行對照，構(gòu)建指紋圖譜疊加圖，并進(jìn)行相似度評價和聚類分析，探討無籽刺梨的親緣關(guān)系。此外，還比較了無籽刺梨分別與10種薔薇屬植物的共有峰數(shù)。

3.3 無籽刺梨化學(xué)親緣關(guān)系的探討

無籽刺梨不產(chǎn)生種子，自然繁殖困難，一般認(rèn)為是一個自然雜交種，野生資源較少，近年來沒有在野外見到實物，缺少遺傳多樣性和選育基礎(chǔ)。目前，大面積栽培無籽刺梨主要依賴無性系繁殖，而大量多代無性繁殖可能會面臨品質(zhì)退化問題[23]。因此，探究無籽刺梨的親緣關(guān)系，進(jìn)一步選育近緣種進(jìn)行雜交，為保存其品質(zhì)提供一定的理論基礎(chǔ)。本研究建立11種薔薇屬植物脂溶性部位的HPLC指紋圖譜，采用相似度評價和聚類分析探討無籽刺梨與10薔薇屬植物的化學(xué)親緣關(guān)系。

指紋圖譜相似度評價是國家公認(rèn)的判定中藥化學(xué)成分相似性的一種方法[21]。一般認(rèn)為其相似度越高，化學(xué)成分就越相似。本研究首次基于化學(xué)分類學(xué)的理論探究無籽刺梨的生物學(xué)發(fā)生及親緣關(guān)系，對收集到的11種薔薇屬植物脂溶性部位化學(xué)成分進(jìn)行分析。相似度分析顯示，與無籽刺梨相比，10種薔薇屬植物中有8種植物的相似度大于85%，這在一定程度上說明薔薇屬植物化學(xué)成分的保守性和穩(wěn)定性較高。其中長尖葉薔薇、繅絲花和無籽刺梨的共有峰最多，為無籽刺梨單峰數(shù)的80.6%和74.2%。聚類分析結(jié)果將11種薔薇屬植物分為4類，其中無籽刺梨與長尖葉薔薇、小果薔薇聚為一類，進(jìn)一步說明無籽刺梨與長尖葉薔薇的化學(xué)成分較其它相似。因此，綜合兩種分析結(jié)果可以看出，無籽刺梨與長尖葉薔薇的化學(xué)成分最相似，可以推測二者在分類學(xué)上有較近的親緣關(guān)系。該結(jié)論與鄧亨寧[8]和陳興銀[11]等針對DNA條形碼的分析推論基本一致。另外，從相似度分析和聚類分析結(jié)果也可以初步判斷無籽刺梨與繅絲花和小果薔薇也有較近的親緣關(guān)系，但是否為無籽刺梨的雜交親本之一仍舊無法判定。

不同類群和物種的植物次生代謝產(chǎn)物盡管具有一定的保守性，但是可能會受到季節(jié)環(huán)境等因素的影響而產(chǎn)生一些變化。因此，無論從化學(xué)成分角度還是某幾種基因片段來推測物種親緣關(guān)系都有一定的局限性。在后續(xù)研究中，或可以將二者有機(jī)結(jié)合，對無籽刺梨產(chǎn)地現(xiàn)有的所有薔薇屬物種進(jìn)行全面的分析，可能會得出更加真實有效的結(jié)論。