田洪益，謝碧華，羅清禮

0 引言

青光眼(glaucoma)是老年人群中常見的眼科疾病，具有不可逆性[1]。青光眼的特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells,RGCs)的進(jìn)行性退化和不能分裂或再生，被視為神經(jīng)干細(xì)胞生成性疾病，與其他疾病如阿爾茨海默氏癥或帕金森病一樣，最終由神經(jīng)功能缺陷引起[2]。青光眼的臨床治療主要有藥物和手術(shù)治療，但其治療效果不是很理想，不能有效阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[3]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種能夠自我更新的多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)作用，包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)等[4]。其中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是具有自我更新的非造血干細(xì)胞，具有多系分化潛能，能夠分化為多種細(xì)胞譜系，如：脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞等[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞玻璃體腔移植是否對(duì)大鼠青光眼模型有改善作用，是否對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料35只體質(zhì)量180～220g Lewis大鼠購自中國科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。IMDM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。Percoll分離液、PBS溶液、茜素紅S、油紅O和葡聚糖四甲基羅丹明購自美國Sigma公司。pGFP-N試劑購自美國Clontech公司。CD29抗體、CD45抗體、CD44抗體、CD90抗體、CD106抗體和CD14抗體購自美國Abcam公司。HE試劑盒購自北京中杉金橋公司。RIPA裂解液購自北京索萊寶公司。IGF1抗體、BDNF抗體、β-actin抗體和山羊抗兔(鼠)IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)取5只雄性Lewis大鼠，采用麻醉處死，立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨，剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍。將股骨兩端剪斷，用2mL無菌注射器吸取IMDM培養(yǎng)基沖出股骨中的骨髓于離心管中，反復(fù)沖洗幾次。將沖出的骨髓吹打成懸液，1000r/min離心5min，棄上清。IMDM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將懸液加入到裝有等體積Percoll分離液的離心管中，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，2000r/min，離心20min。吸取中間骨髓基質(zhì)細(xì)胞層(白色混濁狀)，IMDM培養(yǎng)基洗3次。用含15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基重懸。以1×106/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后棄去培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗2～3次去除未貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d換液1次，以保證細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長的形態(tài)變化。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分化對(duì)于成骨分化，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在含有100nmol/mL地塞米松，0.05mmol/mL抗壞血酸-2-磷酸和10mmol/mL β-甘油磷酸酯的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4wk，進(jìn)行成骨分化。通過用2%茜素紅S(pH 4.1～4.3)染色評(píng)估。對(duì)于成脂分化，通過在含有0.5mmol/mL異丁基-甲基黃嘌呤，100nmol/L地塞米松，10mg/mL胰島素和200μmol/mL吲哚美辛的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)行脂肪形成分化2wk。通過用0.5%油紅O染色細(xì)胞內(nèi)脂滴來顯示脂肪形成分化。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)在第3代后，收獲骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。每1mL細(xì)胞懸液中加入20μL 抗體(CD29抗體、CD45抗體、CD44抗體、CD90抗體、CD106抗體、CD14抗體)，室溫、避光孵育30min后，1000r/min離心5min，棄去上清液。PBS清洗細(xì)胞后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使用FACS Calibur儀器進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。用Cell Quest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 動(dòng)物分組及給藥將30只Lewis大鼠飼養(yǎng)在有鋸屑?jí)|料的標(biāo)準(zhǔn)塑料籠中，室內(nèi)溫度為21℃±2℃，動(dòng)物可以不受限制地獲得食物和水，保持12h光照/12h黑暗循環(huán)，并且在實(shí)驗(yàn)之前使大鼠適應(yīng)環(huán)境至少2wk。將大鼠分別隨機(jī)分為3組：(1)對(duì)照組：建模后第7d向玻璃體腔內(nèi)注射3μL PBS溶液；(2)青光眼模型組：建模后第7d向玻璃體腔內(nèi)注射3μL PBS溶液；(3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組：在建模后第7d向玻璃體腔內(nèi)注射3μL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液(含有1×105個(gè)細(xì)胞)，連續(xù)給藥30d。

1.2.5 模型制作按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行青光眼模型制作。Lewis大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉全身麻醉，將每只大鼠的左眼為實(shí)驗(yàn)眼(青光眼)，右眼為對(duì)照眼。實(shí)驗(yàn)前測(cè)量每只眼的眼內(nèi)壓，在裂隙燈下，從532nm二極管激光器向左眼施加0.75W脈沖(直徑50μm，0.5s)，經(jīng)過50個(gè)激光脈。在第7、14、21、30d測(cè)雙眼眼內(nèi)壓，實(shí)驗(yàn)眼內(nèi)壓比對(duì)照眼內(nèi)壓大于10mmHg(1mmHg=0.133kPa)為青光眼模型制作成功。對(duì)照組只麻醉大鼠，不進(jìn)行手術(shù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)計(jì)劃嚴(yán)格經(jīng)過成都市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2.6 HE染色將視網(wǎng)膜組織快速在10%福爾馬林溶液中固定24h。固定后，視網(wǎng)膜組織樣品包埋于石蠟中并進(jìn)行切片(切片的厚度5μm)。將5μm厚的組織固定在帶正電荷的載玻片上，然后進(jìn)行脫水-再水化，切片進(jìn)行蘇木精-曙紅染色。所有切片均用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.2.7 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)葡聚糖四甲基羅丹明(DTMR)鹽溶液(終濃度1mg/mL)從大鼠玻璃體腔注入，給予DTMR 48h后，將進(jìn)行免疫熒光分析的動(dòng)物處死，并摘除眼球。將眼球在甲醛中固定2h，然后將視網(wǎng)膜移出并平放，使用PBS/甘油(1∶1)將RGC層置于最上方，并標(biāo)記上視網(wǎng)膜的方向。將平置的視網(wǎng)膜放置在顯微鏡載玻片上，并使用適當(dāng)?shù)臑V光片套件立即用免疫熒光顯微鏡進(jìn)行檢查，通過圖像分析軟件Image Pro Plus對(duì)圖像進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.8 TUNEL染色視網(wǎng)膜組織經(jīng)固定、OCT包埋，并制作成6μm厚的冰凍切片。切片滴加蛋白酶K工作液(20μg/mL)，37℃溫育10～30min，PBS清洗3次。接著切片在4%的多聚甲醛溶液中室溫固定5min，PBS清洗3次。然后切片上滴加DNse I反應(yīng)液，37℃溫育30min，PBS清洗3次。用吸水紙小心吸去樣本區(qū)域周圍的多余液體，滴加TdT酶反應(yīng)液于樣本區(qū)域上，于37℃濕盒中孵育60min(避光)，PBS清洗3次。用吸水紙小心吸去樣本周圍的液體，每個(gè)樣本上滴加Streptavidin-Fluorescein標(biāo)記液，放入溫盒中，37℃反應(yīng)30min(避光)，PBS清洗3次。最后DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光反應(yīng)10min，PBS洗滌，加適量封片劑，熒光顯微鏡觀察并拍照。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)(×100) A:第0代，第5d；B:第3代，第4d。

圖2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分化 A：成骨分化(×100)；B：成脂分化(×200)，藍(lán)色表示細(xì)胞核。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMMSCs的免疫表型特征。

1.2.9 Western blot視網(wǎng)膜組織中加入1mL制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白含量。用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含有5%脫脂牛奶的PBS封閉膜1h，之后加入稀釋后的胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)(1∶1000)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)(1∶1000)和β-actin(1∶1000)一抗，4℃搖床上孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入對(duì)應(yīng)于一抗種屬來源的HRP標(biāo)記的二抗(1∶2000)，在室溫?fù)u床上孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)如圖1所示，原代培養(yǎng)第5d出現(xiàn)小集落，細(xì)胞形狀為類圓形；傳至第3代時(shí)，細(xì)胞呈現(xiàn)出大的，扁平的或成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分化如圖2所示，成骨誘導(dǎo)后，用茜素紅S染色將礦物結(jié)節(jié)染色為陽性；成脂誘導(dǎo)后，用油紅O染色發(fā)現(xiàn)中性脂質(zhì)空泡；提示所提取的原代細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)如圖3所示，流式細(xì)胞術(shù)分析數(shù)據(jù)表明BMMSCs表達(dá)CD29，CD44，CD90和CD106，但不表達(dá)CD45和CD14，并且它們?cè)陔S后的傳代中保持其表型。

2.4 大鼠青光眼模型鑒定由表1可以看出，20只大鼠對(duì)照眼、實(shí)驗(yàn)眼的眼內(nèi)壓在各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=20.45，P時(shí)間<0.01；F組間=24.78，P組間<0.01；F組間×?xí)r間=18.34，P組間×?xí)r間<0.01)。在術(shù)后第7、14、21、30d時(shí)大鼠實(shí)驗(yàn)眼的眼內(nèi)壓均明顯高于對(duì)照眼，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明青光眼大鼠模型均建造成功。

2.5 視網(wǎng)膜組織形態(tài)表現(xiàn)如圖4所示，對(duì)照組、青光眼模型組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜厚度分別為345.67±23.12、203.45±13.56、287.89±18.23μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.21，P<0.01)。對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維排列整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量多，視網(wǎng)膜厚度正常；與對(duì)照組比較，青光眼模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維排列不整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，視網(wǎng)膜厚度變薄(P<0.01)；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維細(xì)胞排列較整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和視網(wǎng)膜厚度高于青光眼模型組(P<0.05)。

圖4 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜厚度變化(×200) 單箭頭：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；雙箭頭：視網(wǎng)膜厚度。A：對(duì)照組；B：青光眼模型組；C：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組；D：三組大鼠視網(wǎng)膜厚度比較。bP<0.01 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs 青光眼模型組。

表1 對(duì)照眼和實(shí)驗(yàn)眼術(shù)后第7、14、21、30d的眼內(nèi)壓

2.6 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)如圖5所示，對(duì)照組、青光眼模型組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量分別為1267.34±67.32、632.56±34.78、1057.21±58.32個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.74，P<0.01)。青光眼模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，BMMSCs組大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量高于青光眼模型組(P<0.05)。

2.7 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡如圖6所示，對(duì)照組、青光眼模型組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)量分別為0.68±0.10、5.75±1.13、3.34±0.78個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.58，P<0.001)。青光眼組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯低于青光眼模型組(P<0.05)。

2.8 Western blot如圖7所示，對(duì)照組、青光眼模型組、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1和BDNF蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.62、28.60，均P<0.01)。青光眼模型組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1(0.21±0.07)和BDNF(0.18±0.04)蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(0.57±0.11，0.49±0.12)(均P<0.01)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1(0.38±0.06)和BDNF(0.29±0.05)蛋白表達(dá)量高于青光眼模型組(均P<0.05)。

3 討論

圖5 免疫熒光顯微鏡下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量變化 bP<0.01 vs對(duì)照組；cP<0.05 vs青光眼模型組。

青光眼是一種視神經(jīng)病變，其特征在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性退化。青光眼影響全球7000多萬人，其中約10%是雙眼失明，使其成為不可逆轉(zhuǎn)性失明的主要原因[8]。青光眼可分為兩大類：開角型青光眼和閉角型青光眼。在美國，超過80%的病例是開角型青光眼；然而，閉角型青光眼是造成嚴(yán)重視力喪失的重要原因。開角型和閉角型青光眼均可作為原發(fā)性疾病。繼發(fā)性青光眼可由創(chuàng)傷，某些藥物如皮質(zhì)類固醇，炎癥，腫瘤或諸如色素分散或假去角質(zhì)的病癥引起[9]。因此，早期診斷和治療可以預(yù)防視力喪失。青光眼的神經(jīng)保護(hù)治療宗旨在預(yù)防視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。在某種程度上，降低眼壓可以在一定程度上保護(hù)神經(jīng)，從而防止神經(jīng)元的破壞和減少神經(jīng)節(jié)的不可逆損失[10]。然而，目前沒有保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的預(yù)防性治療。

圖6 TUNEL染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡變化 bP<0.001 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs 青光眼模型組。

干細(xì)胞已經(jīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的神經(jīng)保護(hù)治療。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜干細(xì)胞移植對(duì)青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有保護(hù)作用[11]，MSCs在神經(jīng)保護(hù)療法中具有吸引力[12]。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌BDNF，神經(jīng)生長因子，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)，IGF1等各種細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子[13]。這些由MSCs分泌的因子已被證明可對(duì)缺血[14]、腦缺血再灌注[15]等疾病具有

圖7 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1和BDNF蛋白變化 A：三組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1和BDNF蛋白表達(dá)；B：三組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1蛋白表達(dá)；C：三組大鼠視網(wǎng)膜中BDNF蛋白表達(dá)。bP<0.01 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs 青光眼模型組。

神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明，涉及青光眼治療中MSCs，BMMSCs在動(dòng)物模型中有效維持視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞活力[7]，并且BMMSCs治療青光眼被廣泛研究。在本研究中，我們將大鼠BMMSCs用于大鼠青光眼模型中來研究其對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)的神經(jīng)保護(hù)和整合能力，是否對(duì)青光眼有保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否對(duì)青光眼大鼠模型有保護(hù)作用，我們先提取了大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行了鑒定，得到純度高的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。接著，我們制作了大鼠青光眼模型，并檢測(cè)了大鼠眼內(nèi)壓，結(jié)果表明青光眼大鼠模型均建造成功。為了進(jìn)一步探究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)玻璃體腔移植后的作用，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維排列整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量多，視網(wǎng)膜厚度正常，青光眼組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維排列不整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，視網(wǎng)膜厚度變薄，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維細(xì)胞排列較整齊，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量和視網(wǎng)膜厚度明顯高于青光眼組；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果表明，青光眼模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量明顯高于青光眼組，但低于對(duì)照組；TUNEL染色結(jié)果表明，青光眼模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著高于對(duì)照組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯低于青光眼模型組；Western blot結(jié)果表明，青光眼模型組大鼠視網(wǎng)膜中IGF1和BDNF蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組大鼠的視網(wǎng)膜中IGF1和BDNF蛋白表達(dá)量高于青光眼模型組。因此，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞玻璃體腔移植能治療大鼠青光眼，可以保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

綜上所述，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的玻璃體腔移植可以在體內(nèi)抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其中間充質(zhì)干細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，在青光眼病理過程中對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)起關(guān)鍵作用。