涂冬萍 王柳萍 趙立春 黃志其 翟勇進(jìn) 白隆華 莫長(zhǎng)明

摘 要：該文基于不膨大和膨大的牛大力根的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)篩選到的28 個(gè)牛大力淀粉酶基因進(jìn)行分析。結(jié)果表明：28 個(gè)牛大力淀粉酶相關(guān)蛋白基因編碼的氨基酸序列分子量為20.78～349.39 KDa;均為酸性蛋白部分;部分亞細(xì)胞定位在葉綠體;具有PLN02784 super family、AmyAc-family super family結(jié)構(gòu)域;二級(jí)結(jié)構(gòu)中除MsAm1、MsAm7、MsAm8、MsAm15、MsAm16、MsAm22、MsAm23、MsAm28中α螺旋占比最大外，無(wú)規(guī)則卷曲的比例最大;三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)具有α淀粉酶結(jié)構(gòu)、β淀粉酶結(jié)構(gòu)、異淀粉酶結(jié)構(gòu)等;淀粉酶基因家族共有86 個(gè)作用元件，MsAm9的作用元件最多（42 個(gè)）;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明MsAm15、MsAm16歸于1 類(lèi)，且均具有motif 2、motif 3、motif 7，MsAm4、MsAm24、MsAm26歸于1 類(lèi)，與擬南芥淀粉酶進(jìn)行比對(duì)，AtBM4和MsAm6歸為一類(lèi)，AtAM2和MsAm2歸為一類(lèi)，AtBM8和MsAm5歸為一類(lèi)，AtBM4和MsAm6歸為一類(lèi)，AtAM10和MsAm22歸為一類(lèi)，AtIM3和MsAm17歸為一類(lèi)。這些分析結(jié)果可為今后深入研究28 個(gè)牛大力淀粉酶的生物學(xué)功能和調(diào)控機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，為牛大力根部膨大的研究及品種的改良提供參考。

關(guān)鍵詞：牛大力，轉(zhuǎn)錄組，淀粉酶基因家族，理化特性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）09-1288-12

Abstract：In order to lay the foundation for revealing the growth and development law and screening the genes related to root expansion by studying the biological activity of the amylase gene family of Millettia speciosa. Based on the transcriptome sequencing results of non-enlarged and enlarged root of M. speciosa，28 daphnia magna amylase genes were screened by bioinformatics technology. The results showed that the molecular weights of amino acid sequences encoded by 28 amylase-related protein genes ranged from 20.78 to 349.39 KDa. They were all acidic proteins，some of the subcellular localization was in chloroplast. They had PLN02784 super family and AmyAc-family super family conserved domains. The proportion of random coil in the secondary structure was the largest excluded from MsAm1，MsAm7，MsAm8，MsAm15，MsAm16，MsAm22，MsAm23 and MsAm28. Tertiary structure prediction showed that the amylase of M. speciosa contained α-amylase structure，β-amylase structure，and isoamylase structure. Amylase gene family had 86 functional elements，and MsAm9 had the most functional elements （42）. The phylogenetic tree showed that MsAm15，MsAm16 belonged to the same category and had motif 2，motif 3，motif 7，and MsAm4，MsAm24，MsAm26 belonged to the other same category. Compared to Arabidopsis thaliana anylase，AtBM4 and MsAm6，AtAM2 and MsAm2，AtBM8 and MsAm5，AtBM4 and MsAm6，AtAM10 and MsAm22，AtIM3 and MsAm17 belonged to the same category，respectively. These results could provide a theoretical basis for the further study of biological functions and regulation mechanism of 28 M. speciosa amylase，and provide a reference for the study of root enlargement and improvement of M. speciosa amylase varieties.

Key words：Millettia speciosa，transcription group，amylase gene family，physicochemical characteristics

牛大力為豆科蝶形花亞科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia speciosa）的干燥根。味甘性平，具補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)之效，臨床上對(duì)腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺結(jié)核、慢性支氣管炎等慢性疾病有一定療效（全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組，1986）。主要分布于福建、湖南、廣東、廣西、海南、貴州等地，是兩廣地區(qū)著名的補(bǔ)骨強(qiáng)筋中藥，常用于制作藥膳、藥酒等（廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳，1992;廣東省食品藥品監(jiān)督管理局，2004;南京中醫(yī)藥大學(xué)，2005;劉丹丹等，2009;韋翠萍等，2009;韋玉燕等，2010），為嶺南地區(qū)著名的藥食兩用植物?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明，牛大力具有提高免疫功能、保肝、祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用（周添農(nóng)等，2009;王呈文等，2013;羅軒等，2014;黃翔等，2014;陳蓉蓉等，2014）。隨著牛大力的深入開(kāi)發(fā)利用，除了加工成中成藥外，鮮品制作藥膳的需求迅速增長(zhǎng)，以致價(jià)格不斷攀升。1999 年牛大力干品在產(chǎn)地收購(gòu)價(jià)為每kg 5～6 元，2007 年牛大力鮮品產(chǎn)地收購(gòu)價(jià)已升至 每kg 20元，到2012 年品質(zhì)較好的上等鮮品收購(gòu)價(jià)已暴漲至每kg 80～100 元，但目前市場(chǎng)無(wú)大宗貨源（伍家豪，2014）。

近年來(lái)，隨著野生資源的減少，牛大力種植產(chǎn)業(yè)顯示出了廣闊的發(fā)展前景。但目前牛大力栽培中遇到了根不膨大，無(wú)法結(jié)薯的難題，影響了藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量。經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，同一個(gè)植株的牛大力不同的根性狀差異顯著，結(jié)薯能力不同。目前還未見(jiàn)牛大力根膨大的分子機(jī)理的確切研究和報(bào)道?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)顯著影響了植物膨大根的膨大，其中與木質(zhì)素和淀粉合成及代謝相關(guān)的基因變化明顯（Gui et al.，2011;Wang et al.，2016）。據(jù)報(bào)道，在紫薯儲(chǔ)藏根中，膨大的根淀粉含量下降，β-淀粉酶活明顯提高，淀粉降解加速。研究表明，淀粉酶的活性與儲(chǔ)藏根發(fā)育存在一定的關(guān)系。本研究基于牛大力根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)篩選出的淀粉酶基因家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為今后研究及闡釋淀粉酶對(duì)牛大力根膨大及貯藏的分子機(jī)理提供參考，為牛大力膨大根優(yōu)良品種的選育

及將來(lái)轉(zhuǎn)基因培育牛大力等后期基因工程研究提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

牛大力植株采集于廣西百色市那坡，經(jīng)廣西藥用植物園白隆華研究員鑒定為豆科美麗崖豆藤（Millettia speciosa）的干燥根，兩年生。取同一個(gè)植株中膨大根（肉質(zhì)明顯，較軟，易折斷，較脆，直徑大于2.5 cm）和不膨大根（肉質(zhì)不明顯，纖維性大，較硬，不易折斷，直徑小于1 cm），以該牛大力膨大根和不膨大根植物材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 方法

由武漢華大醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司在Illumina hiSq2500平臺(tái)對(duì)牛大力膨大根和不膨大根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并進(jìn)行序列分析。

基于牛大力根的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及其注釋結(jié)果，將搜索到的注釋為淀粉酶的unigene通過(guò)開(kāi)放閱讀框ORF Finder和預(yù)測(cè)保守域CDS Search在線軟件檢測(cè)確認(rèn)（圖1）。使用ExPAsy軟件對(duì)牛大力淀粉酶基因編碼的氨基酸序列的理化特性進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，并進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。

使用SignalP-5.0及TargetP 1.1 Server分別對(duì) 28 條牛大力淀粉酶序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位。使用SWISS-MODEL在線工具分別對(duì)牛大力淀粉酶進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。使用PlantCARE （Lescot et al.，2002）對(duì)基因的順式調(diào)控元件、增強(qiáng)子和抑制子等進(jìn)行分析。基于淀粉酶的氨基酸序列，采用MEGA7.0鄰接法（Neighbor-joining），構(gòu)建牛大力淀粉酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（bootstrap=1 000）。利用MEME在線工具對(duì)牛大力淀粉酶基因編碼的氨基酸序列motif進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出28個(gè)淀粉酶，其堿基序列可掃描二維碼（圖2）。

2.1牛大力淀粉酶基因家族成員的一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.1 牛大力淀粉酶基因家族成員的鑒定與理化性質(zhì)分析 基于牛大力根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，搜索到注釋為淀粉酶基因的unigene共有28條，然后分別經(jīng)ORF Finder 和CDS Search確認(rèn)具有完整開(kāi)放閱讀框ORF，最后共鑒定到28條牛大力淀粉酶unigene，命名為MsAm1到MsAm28（表1），ORF Finder在線預(yù)測(cè)其編碼的淀粉酶前體氨基酸數(shù)目最少的為MsAm28（256 個(gè)），最大的為MsAm12（4 141個(gè)）。 利用ExPAsy在線軟件對(duì)牛大力淀粉酶基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，牛大力淀粉酶的分子量在20.78～349.39 kDa之間，均為酸性蛋白質(zhì)，帶正電殘基（Arg+Lys）和帶負(fù)電殘基（Asp+Glu）均為0;不穩(wěn)定系數(shù)顯示MsAm1、MsAm8、MsAm15、MsAm16、MsAm18、MsAm21、MsAm25、MsAm27、MsAm28為穩(wěn)定蛋白，其余為不穩(wěn)定蛋白;總平均親水性及脂肪指數(shù)顯示該家族蛋白均屬于親水性蛋白。

2.1.2 牛大力淀粉酶基因序列預(yù)測(cè) 使用PlantCARE對(duì)基因的順式調(diào)控元件、增強(qiáng)子和抑制子等進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該淀粉酶基因家族共有86個(gè)作用元件（圖3），MsAm9的作用元件最多（42個(gè)），其次是MsAm10（41個(gè)），MsAm28的作用元件最少（7個(gè)）。28個(gè)淀粉酶中 均含有Unnamed__4作用元件，其次除了MsAm11外，均含有CAAT-box;除了MsAm1外，均含有STRE 。其次含量豐富的是MYB，除 MsAm8和MsAm28均含有，接下來(lái)依次為 MYC，ARE，MBS，as-1，MYB-like sequence，Unnamed__1，TGACG-motif等。

此外，淀粉酶的表達(dá)除了與根膨大有一定關(guān)系外，還具有廣泛的生物活性。α-淀粉酶能切割淀粉、糖原或多糖的內(nèi)部α-1，4 糖苷鍵，產(chǎn)生短鏈糊精、寡糖、葡萄糖和麥芽糖等產(chǎn)物，該過(guò)程使淀粉黏度迅速降低。α-淀粉酶可以從植物、動(dòng)物或微生物中獲得，不同來(lái)源的α-淀粉酶功能相似，但在最適溫度、pH等應(yīng)用條件上有差異（李文釗等，2017）。劉曉丹等（2017）發(fā)現(xiàn)淀粉酶能顯著降低小麥的糊化特性，從而降低了小麥的品質(zhì)。蘿卜因富含淀粉酶成為一種超低熱量的蔬菜，且對(duì)胃部粘膜的修復(fù)具有很好的促進(jìn)作用，能夠防止胃酸過(guò)多、胃炎及胃潰瘍，同時(shí)能夠增強(qiáng)消化機(jī)能（任喜波等，2012）。β-淀粉酶可能通過(guò)促進(jìn)葉片與角果皮淀粉分解而加強(qiáng)光合產(chǎn)物向籽粒的運(yùn)輸強(qiáng)度，并參與油菜種子中淀粉的調(diào)控（靳舒榮等，2019），且 β-淀粉酶影響著糙米的發(fā)芽（陶澍等，2018）。因此，研究植物中淀粉酶也將為植物的生長(zhǎng)發(fā)育及物質(zhì)的轉(zhuǎn)換等機(jī)理的闡釋提供科學(xué)參考，為將來(lái)基因工程育種提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

CHEN RR，PU HL，JIANG H，et al.，2014. Isolation，purification and antioxidant activity of polysaccharides from Millettia speciosa Champ. [J]. Food Res Dev，35 （3）：31-34. [陳蓉蓉，蒲含林，姜華，等，2014. 牛大力多糖的分離純化及抗氧化活性研究 [J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，35（3）：31-34.]

CHEN XR，LI HB，KANG L，et al.，2013. Correlation analysis of beta-amylase and starch content in late stage of sweet potato tuber swelling? [J]. Food Ind Technol，（19）：93-96. [陳顯讓?zhuān)罴t兵，康樂(lè)，等，2013. 甘薯塊根膨大后期β-淀粉酶和淀粉含量相關(guān)性分析 [J]. 食品工業(yè)科技，（19）：93-96.]

Department of Health，Guangxi Zhuang Autonomous Region，1992. Standard of Traditional Chinese Medicine in Guangxi? [M]. Nanning：Guangxi Science and Technology Press：31-32. [廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳，1992. 廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn) [M]. 南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社：31-32.]

DZIEDZOAVE NT，GRAFFHAM AJ，WESTBY A，et al.，2010. Influence of variety and growth environment on β-amylase activity of flour from sweet potato （Ipomea batatas）? [J]. Food Control，21 （ 2） ：162-165.

Food and Drug Administration of Guangdong，2004. Standards of Traditional Chinese Medicine in Guangdong Province （Volume 1） [M]. Guangzhou：Guangdong Science and Technology Press：40-41. [廣東省食品藥品監(jiān)督管理局，2004. 廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第一冊(cè)） [M]. 廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社：40-41.]

GUI J，SHEN J，LI L，2011. Functional characterization of evolutionarily divergent 4-coumarate：coenzyme a ligases in rice [J]. Plant Physiol，157（2）：574-586.

HUANG X，WANG XP，CHEN XB，2014. Experimental study on the anti-fatigue and anti-stress effects of Chinese herbal medicine Millettia speciosa Champ.? [J]. J Yulin Norm Univ，35 （2）：55-58. [黃翔，王曉平，陳曉白，2014. 中藥牛大力抗疲勞抗應(yīng)激作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，35（2）：55-58.]

JIN SR，WANG YM，CHANG Y，et al.，2019. Analysis of beta-amylase activity and gene family expression in Brassica napus with different harvestindices? [J]. J Crop Sci，45（8）：1279-1285. [靳舒榮，王艷玫，常悅，等，2019. 不同收獲指數(shù)甘藍(lán)型油菜β-淀粉酶活性及其基因家族成員的表達(dá)分析 [J]. 作物學(xué)報(bào)，45（8）：1279-1285.]

KELLY LA，MEZULIS S，YATES CM， et al.，2015.? The Phyre2 veb portal for protein modeling，prediction and analysis [J]. Nat Prot，10：845-858.

LESCOT M，DEHAIS P，MORENU Y，et al.，2002. Database issue [J]. Nucl Acid Res，30（1）：325-327.

LI WZ，ZANG CG，LI Y，et al.，2017. Progress in research and application of alpha-amylase? [J]. Contemp Chem Ind，（11）：122-126. [李文釗，臧傳剛，李義，等，2017. α-淀粉酶的研究與應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 當(dāng)代化工，（11）：122-126.]

LIU DD，TANG LH，WANG Y，et al.，2009. Experimental study of Millettia speciosa Champ. expectorant，antitussive and antiasthmatic effects? [J]. J Guangzhou Univ Trad Chin Med，26 （3）：266-269. [劉丹丹，唐立海，王艷，等，2009. 牛大力祛痰、鎮(zhèn)咳和平喘作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，26（3）：266-269.]

LUO X，LIN CW，CHEN JJ，et al.，2014. Anti-fatigue effects of Millettia speciosa Champ. polysaccharide on mice? [J]. Nat Prod Res Dev，26 （3）：324-328. [羅軒，林翠梧，陳潔晶，等，2014. 牛大力多糖對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，26（3）：324-328.]

LIU XD，PAN ZF，QU LL，et al.，2017. Effects of alpha-amylase on gelatinization properties of wheat? [J]. J Appl Environ Biol，23 （6）：1052-1058. [劉曉丹，潘志芬，琚亮亮，等，2017. α-淀粉酶對(duì)小麥糊化特性的影響 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，23（6）：1052-1058.]

National Compilation Group of Chinese Herbal Medicines，1986. National Compilation of Chinese Herbal Medicines （Volume 1） [M]. Beijing：Peoples Health Press：200. [全國(guó)中草藥匯編編寫(xiě)組，1986. 全國(guó)中草藥匯編：（上冊(cè)） [M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社：200.]

Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，2005. Dictionary of Traditional Chinese Medicine：（Volume 1）? [M]. Shanghai：Shanghai Science and Technology Press：573. [南京中醫(yī)藥大學(xué)，2005. 中藥大辭典（上冊(cè)） [M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社：573.]

REN XB，DAI XY，ZHANG JH，et al.，2012. Study on the difference of amylase activity among different radish varieties? [J]. N Hortic，（22）：21-23. [任喜波，戴希堯，張俊花，等，2012. 不同蘿卜品種淀粉酶活性的差異研究 [J]. 北方園藝，（22）：21-23.]

SUNDARRAM A，2014 . α-Amylase production and applications：A review [J]. J Applenviro Mic，2（4）：166-175.

TAN DX，2018. Analysis of gene expression related to root enlargement of Millettia speciosa Champ. based on transcriptome sequencing? [D]. Nanning：Guangxi University：2. [譚冬秀，2018. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的牛大力根系膨大相關(guān)基因表達(dá)分析 [D]. 南寧：廣西大學(xué)：2.]

TAO S，SONG Y，CAO L，et al.，2018. Changes of amylase activity and related metabolites during brown rice germination? [J]. Anhui Agric Sci，46 （6）：151-153. [陶澍，宋玉，曹磊，等，2018. 糙米發(fā)芽過(guò)程中淀粉酶活力及其相關(guān)代謝產(chǎn)物變化研究 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（6）：151-153.]

TAO X，ZHANG YW，JIANG YS，et al.，2010. Changes of starch content in sweet potato tuber roots during storage? [J]. J Appl Environ Biol，16（5）：741-744. [陶向，張勇為，姜玉松，等，2010. 甘薯塊根儲(chǔ)藏過(guò)程中的淀粉含量變化 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，16（5） ：741-744.]

WANG CW，JI MH，SHU HM，et al.，2013. Extraction technology of total flavonoids from Millettia speciosa Champ. and antioxidant activity of different extracts? [J]. Chem Res Appl，25 （5）：713-717. [王呈文，紀(jì)明慧，舒火明，等，2013. 牛大力總黃酮提取工藝及不同萃取物的抗氧化活性研究 [J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，25（5）：713-717.]

WANG H，YANG J，ZHANG M，et al.，2016. Altered phenylpropanoid metabolism in the maize Lc-expressed sweet potato （Ipomoea batatas） affects storage root development [J]. Sci Rep，6：18645.

WEI CP，LIU DD，TANG LH，et al.，2009. Effects of Millettia speciosa Champ. on immune function in mice? [J]. J Guangzhou Univ Trad Chin Med，26 （6）：539-542. [韋翠萍，劉丹丹，唐立海，等，2009. 牛大力對(duì)小鼠免疫功能的影響 [J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，26（6）：539-542.]

WEI YY，WU FJ，ZENG HS，et al.，2010. Overview research of Millettia speciosa Champ.? [J]. J Guangxi Acad Sci，26 （3）：380-382. [韋玉燕，巫繁菁，曾海生，等，2010. 牛大力研究概況 [J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，26（3）：380-382.]

WU JH，2014. Planting Millettia speciosa Champ. is a new bright spot of future agricultural income generation in Guangxi? [J]. Chin Agric Inform，（23）：154. [伍家豪，2014. 種植牛大力是廣西未來(lái)農(nóng)業(yè)創(chuàng)收新亮點(diǎn) [J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)信息，（23）：154.]

XIE YP，LI HM，WANG X，2008. Trend of amylase activity in sweet potato tubers during storage? [J]. J Jiangsu Agric，24（4）：406-409. [謝逸萍，李洪民，王欣，2008. 貯藏期甘薯塊根淀粉酶活性變化趨勢(shì) [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，24（4）：406-409.]

ZHOU TR，LIU DD，TANG LH，et al. 2009. Protective effect of Millettia speciosa Champ. on acute liver injury induced by carbon tetrachloride and alcohol in mice? [J]. Shizhen Med Nat Med Res，20 （10）：2585-2587. [周添濃，劉丹丹，唐立海，等，2009. 牛大力對(duì)四氯化碳及酒精所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，20（10）：2585-2587.]

（責(zé)任編輯 周翠鳴）