姚璐莎 王雁芳 范伏元

摘要 目的：觀察通痹顆粒對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎繼發(fā)肺間質(zhì)病變模型大鼠的保護(hù)作用，探討通痹顆粒是否是通過(guò)阻斷經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)多方位調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)從而保護(hù)肺臟。方法：60只SD大鼠隨機(jī)分為通痹顆粒組、硫唑嘌呤組和模型組（MC）、正常組（NC），正常對(duì)照組除外，其余各組采用牛Ⅱ型膠原聯(lián)合博萊霉素誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎繼發(fā)肺間質(zhì)病變模型，分別于造模成功后7 d、14 d和28 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察關(guān)節(jié)炎指數(shù)。28 d時(shí)處死大鼠，測(cè)定血清中TNF-α的含量、觀察肺組織切片病理變化。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)階段通痹顆粒組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分由開(kāi)始時(shí)的8.25分最終下降到5.12分，與模型組比較，3個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)得分均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）;28 d時(shí)與模型組比較，通痹顆粒組大鼠血清TNF-α水平（122.59 pg/mL）低于模型組（179.87 pg/mL），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與正常組相當(dāng)（P>0.05）;HE及Masson染色觀察RA-ILD大鼠肺間質(zhì)組織形態(tài)學(xué)顯示，模型組大鼠肺間質(zhì)形態(tài)明顯改變，通痹顆粒與正常組形態(tài)接近。結(jié)論：通痹顆粒對(duì)牛Ⅱ型膠原聯(lián)合博萊霉素誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎繼發(fā)肺間質(zhì)病變具有明顯保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;肺間質(zhì)病變;SD大鼠;通痹顆粒;益氣通絡(luò);炎性反應(yīng);病理變化;保護(hù)作用

Abstract Objective：To observe the protective effect of Tongbi Granule on rats with pulmonary interstitial disease secondary to rheumatoid arthritis， and to investigate whether Tongbi Granules protect the lungs by blocking the classical Wnt signaling pathway and regulating the body′s immune system in multiple directions.Methods：A total of 60 SD rats were randomly divided into normal group（NC），Tongbi Granule group，Azathioprine group and model group （MC）. Bovine type II collagen combined with Bleomycin were used in the other groups to induce pulmonary interstitial disease secondary to rheumatoid arthritis model ，except the normal control group .The arthritis index was observed at three time points：7 d，14 d and 28 d after successful modeling. At 28 days， the rats were sacrificed， the content of TNF-α in serum was measured， and the pathological changes of lung tissue sections were observed. Results：In the experimental stage， the arthritis index score of the Tongbi Granule group was finally reduced from 8.25 at the beginning to 5.12.Compared with the model group， the arthritis index scores of the three observation time points were lower （all p<0.05）. After 28 days， compared with the model group， the serum TNF-α level （122.59 pg/mL） in the Tongbi Granule group was lower than that in the model group （179.87 pg/mL）（P<0.01）. HE and Masson staining observation of lung interstitial tissue morphology of RA-ILD rats showed that the lung interstitial morphology of model rats was significantly changed， and the Tongbi G ranules group was close to the normal group.Conclusion：Tongbi Granule has obvious protective effect on pulmonary interstitial lesions induced by bovine type Ⅱ collagen combined with bleomycin.

Keywords Rheumatoid arthritis; Pulmonary interstitial lesion model; SD Rats; Tongbi Granules; Benefiting qi and unblocking collterals; Inflammatory response; Pathological changes; Protective effect

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.014

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是以關(guān)節(jié)組織慢性炎性反應(yīng)為主要表現(xiàn)的自身免疫病，主要累及周?chē)P(guān)節(jié)，表現(xiàn)為慢性、多發(fā)性、對(duì)稱性關(guān)節(jié)腫脹疼痛[1]。肺間質(zhì)病變（Inierstitial Lung Disease，ILD）是其常見(jiàn)的并發(fā)癥，是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎最常見(jiàn)的死亡原因之一[2]。一般認(rèn)為由于免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化，從而釋放多種細(xì)胞因子造成肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間基底膜的損傷、異常纖維母細(xì)胞增生[3]，炎性反應(yīng)及細(xì)胞外基質(zhì)成分的沉積等，是一個(gè)多因素、多個(gè)環(huán)節(jié)參與的緩慢的錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程[4]。通痹顆粒具有益氣通絡(luò)的作用，其主要組成為黃芪、當(dāng)歸、血竭等，在臨床和實(shí)驗(yàn)中具有很好的療效[5]。RA的肺病變的研究尤為重要。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎繼發(fā)ILD模型[6]，觀察RA大鼠肺組織切片HE和Masson染色及血清TNF-α水平變化，分析通痹顆粒對(duì)肺病變是否具有保護(hù)作用，探討通痹顆粒治療RA合并ILD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只鼠齡5～6個(gè)月齡、體質(zhì)量（200±10）g的雌性SPF級(jí)SD大鼠，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)提供。動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（湘）2015-0003。隨機(jī)分為正常組、通痹顆粒組、硫唑嘌呤組和模型組各15只，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)7 d，燈光照射12 h，并予嚴(yán)格的卡片登記管理，觀察無(wú)異常者入組實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 硫唑嘌呤[7]（Azathio Prine Tablets，AZP）（上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：CAS：446-86-6），2.5 mg/片，來(lái)自;通痹顆粒生產(chǎn)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院自制藥，先取通痹顆粒6 g，用10 mL無(wú)菌生理鹽水溶解，搖勻，制成0.6 g/mL藥液，放至4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑 牛II型膠原凍干口服劑[8]購(gòu)自北京博蕾德生物科技有限公司，貨號(hào)：20021;博萊霉素購(gòu)自天津太河制藥有限公司，批號(hào)：Z8020（1.25 mL）;不完全弗氏佐劑和冰醋酸：由湖南中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只SD大鼠，正常組、通痹顆粒組、硫唑嘌呤組和模型組均按完全隨機(jī)方法分組。正常組正常飲水?dāng)z食，不作任何處理，其余組均通過(guò)牛Ⅱ型膠原聯(lián)合博萊霉素制備RA-ILD模型。造模方法包括：充分溶解牛II型膠原凍干，與不完全弗氏佐劑等體積混合、振蕩乳化，制成牛Ⅱ型膠原，濃度為2 mg/mL。將SD大鼠尾根部5個(gè)部位進(jìn)行皮內(nèi)注射，總量0.3 mg。初次免疫2周后同前法進(jìn)行2次免疫，總量0.3 mg[9]。于首次注射牛Ⅱ型膠原乳劑后18天進(jìn)行評(píng)判。保證注射前后單側(cè)左足踝隆起的體積>1.6 mL，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分>4分。麻醉大鼠后將其仰臥固定于大鼠實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，無(wú)菌條件下做頸部正中切口，充分暴露氣管，注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)朝向心端緩慢注入博萊霉素注射液，劑量為5 mg/（kg·BW），注藥后繼續(xù)注入0.3 mL空氣[10]，藥液充分注入肺內(nèi)，將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，之后縫合皮膚。

1.2.2 給藥方法 模型制備完成后，對(duì)通痹顆粒組、硫唑嘌呤組和MC組大鼠進(jìn)行灌胃治療。MC組大鼠灌胃生理鹽水;硫唑嘌呤組大鼠灌胃硫唑嘌呤藥液，將硫唑嘌呤片研成細(xì)末，加生理鹽水，配置比（每1 mL含硫唑嘌呤2.5 mg），按2.5 mg/（kg·d）的劑量灌胃，1次/周;通痹顆粒組灌胃通痹顆粒藥液（0.3 g/只·d），灌胃2次/d，時(shí)間分別為9：00和15：00，直到處死為止。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù) Wood氏的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[11]，作關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分并記錄。4只足爪分別記錄，最高分16分。模型組評(píng)分與正常組評(píng)分比較經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，作為模型制備成功的依據(jù)。

1.2.3.2 ELISA法檢測(cè)血清TNF-α水平 末次給藥結(jié)束，處死禁食12 h大鼠。麻醉大鼠，分離腹主動(dòng)脈采血，離心機(jī)離心半徑0.8 cm，3 000 r/min，離心5 min，吸取上清，置-20 ℃保存待測(cè)，采用ELISA法檢測(cè)血清TNF-α值。

1.2.3.3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 腹主動(dòng)脈取血后，快速取出右中肺，固定、脫水透明、浸蠟、包埋、切片、制片。脫水后采用HE染色、肺組織切片Masson染色，光學(xué)顯微鏡下明確肺組織情況、檢測(cè)肺間質(zhì)中膠原蛋白沉積情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料用方差分析比較，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組SD大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分 正常組大鼠無(wú)關(guān)節(jié)無(wú)紅腫;給藥前與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（8.02分）明顯高于正常組（0.00分）（P<0.01），說(shuō)明造模成功;與模型組比較，通痹顆粒組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分在給藥7 d（7.45分）、14 d（6.56分）、28 d（5.12分）均低于模型組（P<0.05）。給藥28 d后，通痹顆粒組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（5.12分）低于硫唑嘌呤組（5.92分）（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 不同處理組RA大鼠血清TNF-α水平情況 ? 28 d后4組大鼠血清TNF-α水平組間比較（P<0.01）;與模型組（179.87 pg/mL）比較，正常組血清TNF-α含量較低（121.63 pg/mL）（P<0.05）。與正常組比較，通痹顆粒組SD大鼠血清TNF-α水平（122.59 pg/mL）與之相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，通痹顆粒組血清TNF-α水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 各組RA模型大鼠肺組織病理變化 1）HE染色：光鏡下，正常組大鼠肺泡上皮細(xì)胞及肺泡壁無(wú)明顯病變，余各組大鼠灌胃第2周開(kāi)始出現(xiàn)散在的氣管周?chē)仔苑磻?yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁炎性水腫、間隙增寬，病變程度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。模型組肺間質(zhì)細(xì)胞大量增生，上皮增生，肺泡壁增厚，硫唑嘌呤組及通痹顆粒組間質(zhì)輕度增生，腺泡大小不等，部分已破壞、消失，輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，為淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞取代。見(jiàn)圖1。2）Masson染色：光鏡下，模型組肺膠原組織增生、肺泡壁塌陷，伴大量的膠原纖維增生;硫唑嘌呤組部分小管間質(zhì)纖維化，間質(zhì)纖維增生呈局灶性;正常組肺間質(zhì)無(wú)增生、肺泡壁正常;通痹顆粒組部分肺泡壁塌陷，膠原纖維增生呈局灶性;通痹顆粒組、硫唑嘌呤組與模型組比較，間質(zhì)纖維化程度相對(duì)較輕。見(jiàn)圖2。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)的自身免疫性疾病[13]，臨床表現(xiàn)多樣，是我國(guó)人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要原因之一，且該疾病內(nèi)臟受累十分常見(jiàn)，研究顯示，ILD是其常見(jiàn)的并發(fā)癥。對(duì)于此類患者，現(xiàn)仍缺乏規(guī)范的治療方案，疾病加重，很多藥物治療無(wú)效，致殘率致死率很高。因此，中醫(yī)藥治療本病日益受到臨床研究者及病患們的重視。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎合并ILD多“虛”“瘀”“痰”，并基于“益氣通絡(luò)”理論研制出通痹顆粒，其在理論基礎(chǔ)上多方位起到調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的作用。研究顯示，通痹顆粒合甲氨喋呤能夠顯著降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清VEGF及血清IL-6水平[14]，且起到平衡虛實(shí)、扶正驅(qū)邪，使經(jīng)絡(luò)恢復(fù)通暢，肺臟體用得以恢復(fù)，符合《素問(wèn)》所提出的“血實(shí)宜決之，氣虛宜掣引之[15]。

血清TNF-α水平升高與RA密切相關(guān)，且實(shí)驗(yàn)顯示患者血清TNF-α水平[12]可反映RA患者疾病的活躍程度。本次實(shí)驗(yàn)表明，血清TNF-α水平高，提示機(jī)體炎性反應(yīng)活動(dòng)度較高并與關(guān)節(jié)腫脹積分呈正相關(guān);HE及Masson染色通過(guò)肺組織肺泡壁炎性水腫、肺上皮纖維增生變化，反映肺組織受累情況。由此可見(jiàn)，RA患者本身炎性反應(yīng)因子增加，免疫復(fù)合物沉積于機(jī)體內(nèi)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎性表現(xiàn)，繼而出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹。同時(shí)，由于炎性因子刺激自身免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致自身免疫耐受下降，免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)失衡，氣管及支氣管上皮炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而引起肺組織損害，最終肺功能受到影響。

本研究通過(guò)評(píng)估大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、觀察肺組織病理變化、檢測(cè)血清TNF-α水平顯示：經(jīng)藥物干預(yù)后，通痹顆粒組RA-ILD模型大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分明顯降低，血清TNF-α水平明顯降低，病理形態(tài)學(xué)提示肺組織炎性水腫、纖維增生有所改善。可見(jiàn)通痹顆粒對(duì)于ILD模型大鼠具有一定保護(hù)作用，可能與其抑制上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，降低免疫炎性反應(yīng)，保護(hù)肺系統(tǒng)，延緩并治療肺間質(zhì)纖維化，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，實(shí)現(xiàn)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的治療效果有關(guān)。本研究也為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎繼發(fā)ILD的中藥治療提供了新思路。

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（2019-05-22收稿 責(zé)任編輯：王明）