趙丹，周永升，李艷平，劉海英，張桂琴，張焱

(1.包頭市第四醫(yī)院呼吸內(nèi)科,內(nèi)蒙古包頭014030;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院普通外科,內(nèi)蒙古包頭014016)

非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)是常見的惡性腫瘤，在過去的幾十年中，NSCLC的發(fā)病率和死亡率不斷增加，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。盡管目前對NSCLC的認識不斷加深，但其治療效果依然不甚理想，患者5年生存率仍保持在20%以下[2]。分子靶向治療是目前具有較好前景的治療方法，但分子靶向藥物普遍具有耐藥性，因此，研究新的治療靶點具有重要的價值[3]。腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移是NSCLC進展的主要因素，也是導致患者預后不良的重要原因[4]，故而研究參與NSCLC增殖、轉(zhuǎn)移的潛在分子機制可能是尋找新型靶點的有效途徑。細胞因子信號傳導抑制因子5 (suppressor of cytokine signaling 5, SOCS5) 位于染色體2p21上，廣泛表達于脾臟、淋巴結(jié)、胸腺以及骨髓中的原代B和T細胞中，在調(diào)節(jié)免疫應答方面具有重要作用[5]。近年來研究表明，SOCS5在宮頸癌、肝細胞肝癌和胰腺癌等惡性腫瘤中表達異常，其可直接或間接參與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為的調(diào)控[6-8]。目前關于SOCS5與NSCLC的研究報道少見，其在NSCLC進展過程中發(fā)揮的作用還有待進一步的研究探索。鑒于此，本研究通過癌癥基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫驗證SOCS5在肺癌中的表達情況，并進行相關實驗，以分析SOCS5對NSCLC增殖、遷移和侵襲的作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞系、試劑及儀器 NSCLC細胞系PC-9、A549和SPC-A-1及正常支氣管上皮細胞系16HBE購自中國科學院上海細胞庫。DMEM F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和FBS(美國Hyclone公司)，SOCS5過表達質(zhì)粒(上海吉凱基因公司)，MTS試驗試劑(美國Sigma公司)，Transwell小室和基質(zhì)膠(美國BD公司)，蛋白質(zhì)裂解液和BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒(上海碧云天生物技術公司)，兔多克隆抗體SOCS5、小鼠單克隆抗體PI3K、兔單克隆抗體pPI3K、兔多克隆抗體Akt、兔多克隆抗體pAkt、兔單克隆抗體mTOR、兔單克隆抗體pmTOR(英國abcam公司)，ECL發(fā)光液(北京索萊寶公司)。飽和濕度培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，680型酶聯(lián)儀、1645050型電泳儀(美國Bio-Rad公司)，CX23光學顯微鏡(日本Olympus公司)，SCIENTZ-1200E超聲儀(上海頤習儀器設備公司)。

1.2細胞培養(yǎng)及SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 NSCLC細胞系PC-9、SPC-A-1和正常支氣管上皮細胞系16HBE復蘇后重懸于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，A549細胞復蘇后重懸至含10%FBS的DMEM F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將呈對數(shù)生長的PC-9細胞以3×105個/孔的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，試驗設對照(NC)組和SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(oe-SOCS5)組，細胞培養(yǎng)12 h時，將8 μL脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑、10 μg對照質(zhì)粒與2 mL無血清培養(yǎng)基完全混勻后加入NC組細胞中，8 μL脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑、10 μg SOCS5過表達質(zhì)粒與2 mL無血清培養(yǎng)基完全混勻后加入oe-SOCS5組細胞中，轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3MTS試驗檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期的PC-9細胞以1 500個/孔的細胞密度鋪至96孔細胞培養(yǎng)板中，實驗設NC組和oe-SOCS5組，每組設置6個復孔，細胞接種12 h時，將0.8 μL脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑、1 μg對照質(zhì)粒與0.2 mL無血清培養(yǎng)基完全混勻后加入NC組細胞中，0.8 μL 脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑、1 μg SOCS5過表達質(zhì)粒與0.2 mL無血清培養(yǎng)基完全混勻后加入oe-SOCS5組細胞中進行轉(zhuǎn)染。分別在細胞轉(zhuǎn)染的第0、24、48和72小時，加入MTS試劑，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中溫育2 h后采用680型酶聯(lián)儀檢測各孔在波長490 nm處的吸光度(A)值。試驗重復3次并進行統(tǒng)計分析。

1.4劃痕試驗檢測細胞遷移能力 取上述轉(zhuǎn)染NC和oe-SOCS5 48 h的PC-9細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每組設置3個復孔，待細胞的融合度達95%時，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁后，在6孔細胞培養(yǎng)板正中間用劃痕器垂直劃一條劃痕，去除脫落的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，光學顯微鏡下觀察劃痕寬度，培養(yǎng)48 h后顯微鏡下再次觀察劃痕寬度變化。劃痕愈合比=1-(48 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。實驗重復3次并進行統(tǒng)計分析。

1.5Boyden試驗檢測細胞侵襲能力 BD基質(zhì)膠按1∶10稀釋后鋪至Transwell小室中制成Boyden小室。取上述轉(zhuǎn)染6孔細胞培養(yǎng)板中NC和oe-SOCS5組培養(yǎng)48 h的PC-9細胞，無血清培養(yǎng)基洗滌3次后，用無血清培養(yǎng)基配成濃度為1×106/mL的細胞重懸液，取100 μL加入至基質(zhì)膠，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基。24 h后終止培養(yǎng)，甲醇固定細胞，吉姆薩染色，顯微鏡下拍照，計數(shù)細胞穿膜數(shù)。實驗重復3次并進行統(tǒng)計分析。

1.6western blot檢測 取上述轉(zhuǎn)染的PC-9細胞1×107個，PBS洗滌3次后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白質(zhì)裂解液，采用超聲儀破碎裂解后14 000 r/min離心30 min。采用BCA蛋白質(zhì)濃度檢測試劑盒檢測上清液蛋白質(zhì)濃度，行含10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(80 V，100 min)分離蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)濕法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，80 g/L脫脂奶粉溶液室溫溫育PVDF膜1 h，PVDF膜與目的一抗(兔多克隆抗體SOCS5、小鼠單克隆抗體PI3K、兔單克隆抗體pPI3K、兔多克隆抗體Akt、兔多克隆抗體pAkt、兔單克隆抗體mTOR、兔單克隆抗體pmTOR，1∶500稀釋)4 ℃搖床上溫育過夜，加入羊抗兔IgG抗體或羊抗鼠IgG抗體(1∶8 000稀釋)室溫溫育2 h，ECL化學發(fā)光法曝光條帶。蛋白質(zhì)條帶灰度值用ImageJ軟件測定，目的條帶相對灰度值=目的蛋白條帶的灰度值/內(nèi)參蛋白條帶的灰度值。實驗重復3次并進行統(tǒng)計分析。

1.7TCGA數(shù)據(jù)庫查詢SOCS5在肺癌中的表達情況 采用TCGA數(shù)據(jù)庫查詢SOCS5在肺腺癌和肺鱗癌中的表達情況，在瀏覽器中輸入網(wǎng)址http://ualcan.path.uab.edu/index.html，之后點擊“TCGA analysis”按鍵，在搜索框中輸入“SOCS5”，同時在腫瘤類型中選定肺腺癌或肺鱗癌，直接查詢。在彈出的分析鏈接中選擇“表達”，即可直接得到SOCS5在肺腺癌和肺鱗癌中的表達圖以及統(tǒng)計學結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1TCGA數(shù)據(jù)庫分析SOCS5在肺癌組織中的表達水平 采用TCGA數(shù)據(jù)庫分析SOCS5在肺癌組織中的表達水平，結(jié)果顯示SOCS5mRNA在515例肺腺癌組織中的表達水平低于在59例正常肺組織中的表達(P<0.05)。SOCS5mRNA在503例肺鱗癌組織中的表達水平低于在52例正常肺組織中的表達(P<0.05)。見圖1。

2.2western blot檢測SOCS5在NSCLC細胞系中的表達水平 SOCS5在NSCLC細胞系PC-9、A549和SPC-A-1細胞中的表達水平[分別為(0.12±0.03)、(0.33±0.11)、(0.32±0.09)]均低于在正常支氣管上皮細胞系16HBE中的表達(1.01±0.05),差異有統(tǒng)計學意義(F=76.898，P=0.000)，見圖2A。進一步進行組間兩兩比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOCS5在PC-9細胞中的表達最低(PC-9 vs A549、SPC-A-1、16HBE的LSD-t值分別為3.348、3.189、14.191，P值分別為0.010、0.013、0.000)，故而選擇PC-9進行SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用于后續(xù)實驗。

2.3western blot檢測SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果 SOCS5在oe-SOCS5組細胞中的表達水平(4.54±0.94)明顯高于在NC組細胞中的表達水平(1.01±0.02)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.503，P=0.003)。見圖2B。

2.4MTS試驗檢測細胞增殖能力 SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCLC細胞PC-9后，MTS試驗檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，oe-SOCS5組細胞增殖能力降低(P<0.05)。見圖3、表1。

表1 不同時間點NC組和oe-SOCS5組細胞的A值

2.5劃痕試驗檢測細胞遷移能力 檢測結(jié)果顯示，NC組的細胞劃痕愈合比為(41.27±3.58)%，明顯高于oe-SOCS5組(10.25±4.98)%，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.760，P=0.001)。見圖4A。

2.6Boyden試驗檢測細胞侵襲能力 檢測結(jié)果顯示，SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCLC細胞PC-9后， NC組的細胞穿膜數(shù)為(126.67±13.87)個，明顯高于oe-SOCS5組的細胞穿膜數(shù)[(52.33±9.35)個]，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.698，P=0.002)。見圖4B。

2.7western blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路活性 檢測結(jié)果顯示，SOCS5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCLC細胞PC-9后，與NC組相比，oe-SOCS5組細胞PI3K、Akt和mTOR總蛋白質(zhì)的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白的表達降低(P<0.05)。見圖5、表2。

3 討論

研究表明，包含1個中央Src-同源結(jié)構(gòu)域和1個C末端保守的SOCS結(jié)構(gòu)域的SOCS蛋白家族在細胞因子信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控中起關鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，SOCS家族成員與炎性疾病和多種惡性腫瘤密切相關，其成員的異常表達參與了這些疾病的發(fā)生和進展[9-10]。家族成員之一的SOCS5與TH細胞分化有關，尤其在維持TH1和TH2細胞之間的平衡中發(fā)揮重要作用[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),SOCS5的表達異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，SOCS5可以調(diào)控急性淋巴細胞白血病細胞的生長和細胞周期，SOCS5沉默誘導Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號轉(zhuǎn)導激活，促進急性淋巴細胞白血病的發(fā)生[11]。SOCS5在肝細胞肝癌組織中過表達，并與患者的預后呈負相關，SOCS5過表達促進了腫瘤細胞的遷移和侵襲[7]。由此可見，SOCS5既可以發(fā)揮癌基因的功能，又可以發(fā)揮抑癌基因的功能，其功能的發(fā)揮取決于腫瘤類型。

TCGA數(shù)據(jù)庫是由美國國家腫瘤研究所和美國國家人類基因組研究所共同組建，是研究腫瘤的重要資源。本研究通過在TCGA數(shù)據(jù)庫中搜索，發(fā)現(xiàn)SOCS5在肺腺癌和肺鱗癌中的表達均降低，且通過細胞實驗證實，SOCS5在NSCLC細胞中的表達均低于在正常支氣管上皮細胞系16HBE中的表達，這與TCGA數(shù)據(jù)庫中SOCS5在肺癌組織中的表達情況具有一致性，SOCS5在NSCLC中呈異常低表達，提示SOCS5在NSCLC中可能發(fā)揮抑癌因子的作用。既往研究顯示，SOCS5的表達異常與腫瘤的增殖和遷移相關[6-8]。本研究在NSCLC細胞中轉(zhuǎn)染SOCS5過表達質(zhì)粒，結(jié)果顯示SOCS5可以抑制NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲能力，表明SOCS5在NSCLC中下調(diào)可促進腫瘤的惡性進展，與Sharma等[11]在白血病中的研究結(jié)果具有一致性，但與Zhang等[7]在肝細胞癌中的報道結(jié)果相反，分析原因可能與調(diào)控的作用機制相關，因此其作用機制仍需進一步研究。PI3K/Akt/mTOR信號通路是促進腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的重要信號通路之一，該信號通路在NSCLC中處于激活狀態(tài)[12-13]。在肝細胞癌[7]、骨肉瘤[14]中SOCS5均可通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路參與腫瘤的惡性進展。本研究結(jié)果顯示，SOCS5過表達可降低pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白的表達，即在NSCLC中SOCS5過表達可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活，這可能是SOCS5調(diào)控NSCLC惡性生物學行為的分子機制之一。本研究還發(fā)現(xiàn)SOCS5在NSCLC中呈低表達，并能通過調(diào)控經(jīng)典的腫瘤相關信號通路PI3K/Akt/mTOR，參與腫瘤細胞的惡性進展。但是腫瘤的調(diào)控錯綜復雜，SOCS5抑制NSCLC細胞進展的過程也可能涉及多種信號途徑，而本實驗僅研究了1條信號通路；另一方面，本研究僅分析了過表達SOCS5對NSCLC細胞惡性進展的影響，并未分析抑制SOCS5表達時的情況，若加入該部分內(nèi)容將使得研究結(jié)果更具說服力，這些不足之處將在后續(xù)研究中不斷完善。

表2 NC組和oe-SOCS5組細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達