江蘇省醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)分會(huì)，江蘇省臨床檢驗(yàn)中心

宏基因組學(xué)(metagenomics)也稱元基因組學(xué)，其利用新一代高通量測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)，以特定環(huán)境下病原體基因組為研究對(duì)象，在分析病原體多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究病原體的群體功能活性、相互作用及其與環(huán)境之間的關(guān)系，發(fā)掘潛在的生物學(xué)意義。宏基因組測(cè)序(metagenome next-generation sequencing, mNGS)是基于宏基因組學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)，可檢測(cè)并分析各種臨床來(lái)源樣本中所有已知及未知的病原體(包含細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體/衣原體等)。mNGS適用于各種病原體的鑒定，特別是未知新發(fā)病原體，如新型冠狀病毒、新型布尼亞病毒等，故在新發(fā)突發(fā)、復(fù)雜及混合感染的病原體實(shí)驗(yàn)室診斷中，其臨床參考價(jià)值更為突出[1-2]。

mNGS技術(shù)規(guī)避了絕大多數(shù)病原體不能培養(yǎng)或難培養(yǎng)的缺點(diǎn)；直接檢測(cè)臨床樣本中的病原體核酸，解決了新發(fā)或罕見病原體鑒定難的問(wèn)題；覆蓋更全、更廣的病原體種類，克服了常規(guī)分子診斷技術(shù)需要事先知道基因靶標(biāo)的困難。病原體mNGS檢測(cè)有其特殊性，如核酸提取前人源宿主核酸的去除、基于痕量/微量病原體核酸(如病毒)文庫(kù)的構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析中基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立、報(bào)告解讀中不同樣本來(lái)源各種病原體檢出閾值的設(shè)立、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的實(shí)施等。構(gòu)建高效快速實(shí)驗(yàn)流程和數(shù)據(jù)分析流程、設(shè)計(jì)合理可行的性能確認(rèn)方案、積極充分的臨床調(diào)研和溝通等，都是實(shí)驗(yàn)室開展項(xiàng)目前的必要工作。

為進(jìn)一步規(guī)范mNGS病原體檢測(cè)項(xiàng)目的臨床開展，江蘇省醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)分會(huì)、江蘇省臨床檢驗(yàn)中心組織江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、感染病學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)專家，就實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的基本要求、實(shí)驗(yàn)方法學(xué)的性能確認(rèn)、質(zhì)量控制體系的建立和健全、結(jié)果的分析和解讀及在感染性疾病診斷中的價(jià)值，制定本專家共識(shí)。

1 mNGS實(shí)驗(yàn)室的基本要求

1.1實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)

共識(shí)1：開展mNGS臨床檢測(cè)的非法人資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室、法人資質(zhì)的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，都必須具備以下資質(zhì)：醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證、“臨床細(xì)胞與分子遺傳學(xué)專業(yè)”診療科目、Ⅱ級(jí)或以上生物安全實(shí)驗(yàn)室備案證書、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)驗(yàn)收合格證[感染類病原體基因項(xiàng)目(NGS平臺(tái))]。

1.2符合生物安全實(shí)驗(yàn)室的基本要求 應(yīng)用mNGS技術(shù)檢測(cè)潛在感染性病原體的樣本來(lái)源于臨床確診或擬診感染的患者，故樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、接收、處理、操作、保存及實(shí)驗(yàn)室的場(chǎng)地、設(shè)計(jì)、分區(qū)、流程等環(huán)節(jié)，都必須按照國(guó)家已經(jīng)發(fā)布的法規(guī)、準(zhǔn)則、指南等管理文件中的相關(guān)內(nèi)容實(shí)施。

共識(shí)2：在選擇實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所時(shí)要充分考慮人流、物流、樣本流的單向通道，送風(fēng)口、排風(fēng)口及氣流的單向流動(dòng)的設(shè)置，核心實(shí)驗(yàn)區(qū)域及緩沖區(qū)的負(fù)壓設(shè)置，生物安全柜的選擇，互鎖門及門禁的設(shè)置，工作人員配備相應(yīng)防護(hù)設(shè)備，實(shí)驗(yàn)室清潔、消毒場(chǎng)地，醫(yī)療廢棄物的處理和運(yùn)輸?shù)戎匾蛩?。?shí)驗(yàn)室可參考國(guó)家相關(guān)文件，如國(guó)務(wù)院424號(hào)令《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》、GB 50346-2011《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》、T/CECS662-2020《醫(yī)學(xué)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》、GB 19781-2005/ISO 15190:2003《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全要求》、GB 19489-2008《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》、中國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS233-2017《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》，以確保實(shí)驗(yàn)人員的健康、保護(hù)樣本完整性和環(huán)境安全。

1.3實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

共識(shí)3：mNGS技術(shù)平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)操作至少包括試劑配制、樣本接收和前處理、核酸提取、文庫(kù)構(gòu)建、基因擴(kuò)增、上機(jī)測(cè)序等步驟，故實(shí)驗(yàn)室原則上應(yīng)設(shè)置以下區(qū)域：標(biāo)本接收區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、文庫(kù)構(gòu)建區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、質(zhì)檢區(qū)和測(cè)序區(qū)、數(shù)據(jù)分析及報(bào)告區(qū)。

實(shí)驗(yàn)室具體可根據(jù)實(shí)際情況及其面積因地制宜進(jìn)行分區(qū)，而對(duì)于核心實(shí)驗(yàn)操作區(qū)，如標(biāo)本制備區(qū)、文庫(kù)構(gòu)建區(qū)等，必須設(shè)置緩沖區(qū)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求可參照GB/T 20469-2006《臨床實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)總則》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號(hào))及其附件》、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作導(dǎo)則》實(shí)施。

1.4實(shí)驗(yàn)室人員資質(zhì) 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備可滿足開展該平臺(tái)檢測(cè)要求的醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、生物信息學(xué)等專業(yè)人員。

共識(shí)4：實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或技術(shù)負(fù)責(zé)人(碩士以上學(xué)歷者優(yōu)先)，具有副高以上職稱及相關(guān)專業(yè)背景，且有5年及以上臨床基因檢驗(yàn)工作經(jīng)歷。實(shí)驗(yàn)室的操作人員、生物信息學(xué)分析人員、報(bào)告解讀和簽發(fā)人員，應(yīng)具備臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員崗位培訓(xùn)合格證書(感染類)。報(bào)告解讀與簽發(fā)者須具有2年以上感染類檢驗(yàn)工作經(jīng)歷，同時(shí)具備衛(wèi)生專業(yè)職稱證書(檢驗(yàn)醫(yī)師優(yōu)先)。

實(shí)驗(yàn)室人員數(shù)量可根據(jù)開展項(xiàng)目及工作量進(jìn)行配備，工作人員需要參加必要的外部培訓(xùn)和充分的內(nèi)部培訓(xùn)，并通過(guò)人員能力考核和評(píng)估后方可上崗。

2 建立mNGS技術(shù)平臺(tái)上的實(shí)驗(yàn)方法及質(zhì)量評(píng)估

2.1樣本采集、存放、運(yùn)送的要求 mNGS技術(shù)平臺(tái)采集的樣本包括外周血、肺泡灌洗液、腦脊液、痰液、胸腹水、尿液、分泌物、組織(皮膚、眼角膜)、糞便等，故對(duì)樣本采集數(shù)量、保存液、容器均有一定的要求。標(biāo)本采集和保存可參照《臨床微生物標(biāo)本規(guī)范化采集和送檢中國(guó)專家共識(shí)》等規(guī)范進(jìn)行，對(duì)于特殊要求如全血中血漿游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)檢測(cè)需采用專用保存管；無(wú)法立即檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)放在適當(dāng)?shù)谋４婀苤兄糜?80 ℃保存；需要外送檢測(cè)的標(biāo)本，要符合相應(yīng)的標(biāo)本轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)范；同時(shí)在mNGS項(xiàng)目開展前應(yīng)在臨床科室進(jìn)行樣本采集的培訓(xùn)工作。

2.2核酸提取及質(zhì)量評(píng)估

2.2.1樣本前處理

共識(shí)5：晨痰樣本因含大量黏蛋白，推薦采用二硫蘇糖醇和蛋白酶K進(jìn)行液化處理[3]。血液樣本可根據(jù)檢測(cè)目的決定是否需進(jìn)行血漿分離。臨床樣本中人源核酸含量高，約占90%以上，須最大程度去除人源干擾，濾膜過(guò)濾、差異裂解、探針?lè)聪虿东@等方法均可降低樣本中人源核酸的比例，故實(shí)驗(yàn)室應(yīng)針對(duì)不同類型的樣本制定相應(yīng)的樣本前處理方法，可進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。

2.2.2核酸提取及打斷 核酸提取是保證mNGS檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)不同樣本來(lái)源和檢測(cè)目的，選擇合適的核酸提取方法和試劑，經(jīng)質(zhì)量評(píng)估后制定相應(yīng)的核酸提取方法和質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operation procedure, SOP)文件。

共識(shí)6：血液樣本提取循環(huán)cfDNA；痰液、肺泡灌洗液、腦脊液、胸腹水、尿液、分泌物、糞便等提取混懸DNA或總RNA。常用的核酸提取方法為柱提法、磁珠法，推薦使用自動(dòng)化儀器提取。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)檢測(cè)目的及實(shí)際情況設(shè)立合適的核酸打斷方法，通常采用機(jī)械法和酶解法。

2.2.3核酸質(zhì)量評(píng)估 核酸提取后的質(zhì)量評(píng)價(jià)包括純度、濃度、完整性，常用的方法包括瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度法、熒光分析法等。各類樣本核酸提取的最低標(biāo)準(zhǔn)為核酸總質(zhì)量不低于3 ng或每毫升提取量不小于1 ng(其中，外周血樣本為總質(zhì)量不低于30 ng或每毫升提取量不小于10 ng)，對(duì)于達(dá)不到最低標(biāo)準(zhǔn)的樣本需要重新提取核酸或重新采集樣本。經(jīng)打斷后的核酸需由生物分析儀測(cè)定片段分布，合適片段(一般測(cè)序片段為200～300 bp)占比應(yīng)≥90%。

2.3文庫(kù)制備及質(zhì)量評(píng)估 DNA文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)流程通常包括末端修復(fù)、連接接頭、PCR富集、純化、克隆生成。RNA文庫(kù)制備流程包括去除核糖體、反轉(zhuǎn)錄及雜交、片段化、第一/二鏈合成、末端修復(fù)、連接接頭、PCR富集、純化、克隆生成。因采用不同建庫(kù)試劑盒制備DNA、RNA文庫(kù)的流程略有不同，制備好的文庫(kù)一般使用生物分析儀和/或定量PCR等方法進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并設(shè)定明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)文庫(kù)總質(zhì)量<25 ng或擴(kuò)增比例<6時(shí)，提示警戒。文庫(kù)經(jīng)定量后，需調(diào)整摩爾濃度，以便提高測(cè)序質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)測(cè)序儀類型，摸索上機(jī)測(cè)序文庫(kù)終摩爾濃度，經(jīng)評(píng)估后制訂SOP文件。

2.4試劑及儀器 mNGS技術(shù)平臺(tái)中包括建庫(kù)、純化、標(biāo)簽、測(cè)序等試劑：建庫(kù)試劑(如擴(kuò)增法)為合成引物、通用酶，純化和緩沖液為化學(xué)試劑，標(biāo)簽和上機(jī)測(cè)序?yàn)橥ㄓ迷噭Ｉ蠙C(jī)測(cè)序試劑在使用時(shí)應(yīng)避免用于吸附流動(dòng)DNA片段的槽道Flow Cell受冷熱反復(fù)變化的影響，并確保Flow Cell放置于正確的位置。

共識(shí)7：優(yōu)先選用國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)批準(zhǔn)的有注冊(cè)證的試劑，并保證試劑在有效期內(nèi)使用。每一批配制的試劑都需要用曾檢測(cè)過(guò)的且盡量覆蓋多種病原體結(jié)果的樣本進(jìn)行質(zhì)控，并進(jìn)行試劑分裝、儲(chǔ)存時(shí)間等有效性驗(yàn)證，驗(yàn)證過(guò)程應(yīng)形成SOP并進(jìn)行記錄。

測(cè)序儀器的選擇要結(jié)合檢測(cè)目的、運(yùn)行成本、測(cè)序通量、測(cè)序讀長(zhǎng)、運(yùn)行時(shí)間、測(cè)序質(zhì)量等指標(biāo)，綜合選擇合適的高通量測(cè)序平臺(tái)?，F(xiàn)用于mNGS病原體檢測(cè)的高通量測(cè)序儀主要有NextSeq550Dx、BGISEQ-50、BES4000等，另外還需要配置PCR儀、核酸提取儀和濃度測(cè)定儀、離心機(jī)和移液槍等常用分子生物學(xué)儀器設(shè)備。

2.5生物信息分析

2.5.1數(shù)據(jù)庫(kù)的評(píng)估

共識(shí)8：構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)覆蓋所有已知病原體基因組或保守基因，種類大于2萬(wàn)種，包括細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體/衣原體、分枝桿菌等，并及時(shí)更新。已知人間傳染的病原體和臨床關(guān)注的重要病原體是數(shù)據(jù)庫(kù)建立和評(píng)估的關(guān)鍵點(diǎn)。

2.5.2測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量的評(píng)估 測(cè)序后堿基識(shí)別生成的序列稱之為原始序列(raw reads)，去除接頭、低質(zhì)量堿基、過(guò)短的序列后的為有效序列(clean reads)。

共識(shí)9：測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)與人全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，將滿足比對(duì)條件的人源宿主數(shù)據(jù)過(guò)濾，剩余未比對(duì)成功的數(shù)據(jù)通過(guò)物種分類軟件和病原體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，完成鑒定病原體步驟。

測(cè)序后下機(jī)合格數(shù)據(jù)的要求：Flow Cell的堿基質(zhì)量值(Q30)>87%，拆分比例>80%；單個(gè)樣本有效序列數(shù)<800萬(wàn)。當(dāng)標(biāo)本中非人源序列數(shù)過(guò)少，如外周血、胸腹水、腦脊液等標(biāo)本有效序列數(shù)<50萬(wàn)；痰液、灌洗液等標(biāo)本有效序列數(shù)<100萬(wàn)時(shí)，提示警戒(此數(shù)據(jù)供解讀時(shí)參考。對(duì)于數(shù)據(jù)量不足的樣本，仍需重新檢測(cè))。當(dāng)一批檢測(cè)中20%以上的樣本均不合格時(shí)，判定該批次測(cè)序數(shù)據(jù)不合格，需重新上機(jī)檢測(cè)。

3 mNGS項(xiàng)目的性能確認(rèn)及質(zhì)量控制

3.1項(xiàng)目的性能確認(rèn) 根據(jù)已構(gòu)建mNGS技術(shù)平臺(tái)上的實(shí)驗(yàn)方法(實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)包括核酸抽提、文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、生物信息分析)進(jìn)行項(xiàng)目性能確認(rèn)，性能確認(rèn)指標(biāo)至少包括準(zhǔn)確性、精密度、最低檢出限。應(yīng)先建立生物信息分析的性能確認(rèn)，再使用已選擇的試劑和儀器進(jìn)行實(shí)驗(yàn)流程的性能確認(rèn)，然后完成整個(gè)項(xiàng)目的性能確認(rèn)。

3.1.1生物信息分析的性能確認(rèn) 從病原體數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)選取1 000個(gè)物種，每個(gè)物種模擬生成10～100條序列，與人基因組序列進(jìn)行混合(人源序列約占90%)，按分時(shí)、分批、分人驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)和生信分析者的能力進(jìn)行物種鑒定的評(píng)估。生物信息分析結(jié)果正確的物種占比≥90%，即≥900個(gè)物種時(shí)，生物信息分析質(zhì)量的性能確認(rèn)合格。

3.1.2準(zhǔn)確性

共識(shí)10：針對(duì)各種樣本來(lái)源，如外周血、肺泡灌洗液、腦脊液、痰液、分泌物等，分別進(jìn)行準(zhǔn)確性評(píng)估。每種樣本類型的樣本數(shù)不低于20例，根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照，分別計(jì)算陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總體符合率、NGS檢出率(而其他實(shí)驗(yàn)方法未檢出)和NGS漏檢率。

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室自建分子診斷項(xiàng)目基本要求專家共識(shí)》，陽(yáng)性符合率應(yīng)≥90%。

3.1.3精密度

共識(shí)11：至少采用5例樣本進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估精密度。批內(nèi)重復(fù)性采用等分割樣本法，在同一時(shí)間，由同一實(shí)驗(yàn)人員使用相同的儀器、試劑、實(shí)驗(yàn)操作流程、分析方法進(jìn)行評(píng)估；批間重復(fù)性采用分割樣本法，由不同的操作人員，在不同時(shí)間，使用相同的儀器、試劑、操作流程、分析方法進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)使用多臺(tái)基因擴(kuò)增儀或測(cè)序儀器時(shí)，須評(píng)估儀器間重復(fù)性。

NGS檢測(cè)中≥3條物種序列結(jié)果的吻合度≥90%，則判定2次重復(fù)結(jié)果吻合，吻合率≥90%則判定為合格。

3.1.4最低檢出限 選取數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的多種病原體(需覆蓋最常見細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等)構(gòu)成測(cè)試參考品，對(duì)于某些難以獲得的病原體可使用核酸模擬樣本(如假病毒、核酸片段等)。以相同濃度制備成10、101.5、102、102.5、103、103.5、104拷貝/mL的7個(gè)梯度，分別與人類基因組(優(yōu)選陰性臨床樣本或細(xì)胞系等)并參考臨床水平適量混合。按照實(shí)驗(yàn)SOP操作，達(dá)到95%檢出的最低濃度即為相應(yīng)的最低檢出限，根據(jù)各種樣本的最低檢出限設(shè)定合理的病原體報(bào)告閾值，當(dāng)?shù)陀?0拷貝/mL，需設(shè)置低濃度梯度(如100.1、100.2、100.3、100.4、100.5)繼續(xù)測(cè)試。

3.2室內(nèi)質(zhì)控物的確認(rèn)

共識(shí)12：在利用mNGS技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)病原體的過(guò)程中，因病原體核酸結(jié)果的準(zhǔn)確性容易受到樣本類型、檢測(cè)方法、環(huán)境等多重因素的影響，故每批次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陰性質(zhì)控物、陽(yáng)性質(zhì)控物，且與受檢樣本的檢測(cè)過(guò)程保持一致。

陽(yáng)性質(zhì)控物宜接近臨床樣本，如已知檢測(cè)結(jié)果的臨床樣本，或自制包含DNA病毒(人巨細(xì)胞病毒)、RNA病毒(人免疫缺陷病毒)、細(xì)菌(肺炎克雷伯菌、鏈球菌)、真菌(黑曲霉)、酵母(新型隱球菌)和寄生蟲(剛地弓形蟲)核酸或基因序列的質(zhì)控品[4]。陰性質(zhì)控物包括試劑空白對(duì)照和環(huán)境監(jiān)測(cè)對(duì)照，試劑空白陰性對(duì)照主要監(jiān)控實(shí)驗(yàn)耗材如PCR管、各種試劑(如酶和配套測(cè)序試劑盒)、超純水、自配的緩沖液等是否存在污染；環(huán)境監(jiān)測(cè)陰性對(duì)照主要監(jiān)控實(shí)驗(yàn)環(huán)境是否存在核酸交叉污染或遺留擴(kuò)增子污染。mNGS病原體檢測(cè)屬于定性檢測(cè)，需定期統(tǒng)計(jì)陰、陽(yáng)性質(zhì)控物以及常規(guī)檢測(cè)樣本的符合率，陽(yáng)性符合率的降低可能提示分析靈敏度的降低，原因可能有試劑缺陷、操作過(guò)程差錯(cuò)等，而對(duì)于同一批次高比例樣本數(shù)或多個(gè)連續(xù)批次出現(xiàn)陽(yáng)性，可能提示存在污染。一旦出現(xiàn)失控，應(yīng)及時(shí)分析原因，確定合適的糾正措施并加以實(shí)施，防止失控再次發(fā)生。

3.3制定實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的質(zhì)評(píng)方案 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南》等相關(guān)要求，定期參加相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)/能力驗(yàn)證，以持續(xù)保證NGS技術(shù)平臺(tái)的質(zhì)量。mNGS在感染性病原體領(lǐng)域應(yīng)用的室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目，目前國(guó)內(nèi)已開展的有中國(guó)食品藥品檢定研究院組織的病原體宏基因組二代測(cè)序檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)，國(guó)家/省衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心組織的病毒核酸檢測(cè)、新型冠狀病毒核酸檢測(cè)、病毒基因分型等室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目。

共識(shí)13：由于mNGS可檢測(cè)到一些較罕見的病原體，應(yīng)與其他開展mNGS技術(shù)平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)室[如已獲得中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)(CNAS)認(rèn)可或國(guó)際認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室、使用相同測(cè)序平臺(tái)的實(shí)驗(yàn)室等]進(jìn)行室間結(jié)果比對(duì)，每年至少2次，以定期評(píng)估實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量與能力，一旦發(fā)現(xiàn)結(jié)果可比性存在問(wèn)題，需及時(shí)分析以查找原因，并采取糾正措施和預(yù)防措施。

3.4制定項(xiàng)目SOP文件及相關(guān)記錄表 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過(guò)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法的建立和優(yōu)化及性能確認(rèn)的過(guò)程，建立及完善檢測(cè)系統(tǒng)，明確常規(guī)檢測(cè)過(guò)程中每個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)控指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)，形成項(xiàng)目的SOP文件體系及其實(shí)驗(yàn)流程記錄表，并不斷更新。SOP內(nèi)容需包括項(xiàng)目的檢測(cè)全過(guò)程，包括所涉及的試劑組分、試劑原料的來(lái)源、試劑配制方法、引物結(jié)合或探針捕獲的區(qū)域、軟件及數(shù)據(jù)庫(kù)的版本、質(zhì)控物的配制與評(píng)價(jià)等。同時(shí)還需建立檢測(cè)操作全過(guò)程(分析前、中、后)的SOP文件，包括樣本采集、運(yùn)送、處理和保存；核酸的提取、片段化、文庫(kù)的構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)檢、室內(nèi)質(zhì)控、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)操作；生物信息分析、結(jié)果報(bào)告和解釋及進(jìn)一步的建議等。對(duì)于復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)流程可采用分段簡(jiǎn)易操作卡的形式，以保證實(shí)驗(yàn)各環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)、有序地進(jìn)行，確保檢測(cè)過(guò)程及其結(jié)果記錄的真實(shí)性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。工作人員在檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格按照SOP執(zhí)行，并在樣本接收、核酸處理、試劑配制、操作流程、儀器運(yùn)行、室內(nèi)質(zhì)控分析、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析、醫(yī)療廢棄物處理等表格中做好相關(guān)記錄。

4 mNGS項(xiàng)目的報(bào)告內(nèi)容及結(jié)果解讀

4.1結(jié)果分析及檢測(cè)報(bào)告單 在mNGS檢測(cè)報(bào)告單中至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：項(xiàng)目名稱、患者基本信息、臨床診斷、樣本類型和性質(zhì)、唯一標(biāo)識(shí)、采樣時(shí)間、收樣時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間等，以及檢測(cè)方法和局限性、儀器設(shè)備、數(shù)據(jù)庫(kù)版本、檢測(cè)者、審核者、報(bào)告者、結(jié)果提示或建議等。

4.2在報(bào)告單中備注專用名稱

4.2.1測(cè)序深度 指該病原體基因組某段區(qū)域被檢測(cè)到的次數(shù)，深度越高說(shuō)明該病原體檢測(cè)結(jié)果的可信度越高，深度高低也反映病原體在樣品中的相對(duì)含量。

4.2.2基因組覆蓋度 指檢測(cè)到的病原體序列覆蓋到整個(gè)病原體基因組上的比例，覆蓋度越高說(shuō)明該病原體全基因組檢測(cè)到的比例越高。

4.2.3檢出序列數(shù)(reads) 指特異且唯一比對(duì)到該病原體基因組上的序列數(shù)目，是一個(gè)以絕對(duì)值形式出現(xiàn)的相對(duì)值，序列數(shù)和樣本量、樣本中病原體的含量、核酸提取量、人源序列占比相關(guān)，在同一大類病原體(如同屬于細(xì)菌大類)中，序列數(shù)越高說(shuō)明該病原體存在的可信度越高。

4.2.4相對(duì)豐度 指該病原體在所有被檢測(cè)到的同一大類型病原體中的比例。

4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解讀

共識(shí)14：測(cè)序深度、基因組覆蓋度和檢出序列數(shù)均是判斷檢出病原體可信度的指標(biāo)，在報(bào)告單中可采用列表形式顯示病原體的種屬分類信息和相應(yīng)的序列數(shù)，種屬信息須同時(shí)列出中文名和拉丁名，并把最有診斷或提示價(jià)值的病原體列在前幾位。

對(duì)于疑似背景微生物，在不排除疑似背景微生物引起感染可能的情況下，可綜合文獻(xiàn)報(bào)道、積累樣本數(shù)據(jù)、健康人流行病學(xué)數(shù)據(jù)，確定疑似背景微生物列表，供臨床診斷時(shí)參考。

4.4報(bào)告審核

共識(shí)15：在mNGS平臺(tái)檢測(cè)人員進(jìn)行初步數(shù)據(jù)分析后，由生物信息分析人員審核實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析結(jié)果，從事微生物或病原體檢驗(yàn)的高年資工作人員審核報(bào)告結(jié)果。對(duì)于臨床診斷、治療藥物史、臨床表現(xiàn)等提示存在某種感染時(shí)，需要在結(jié)果分析和審核時(shí)重點(diǎn)關(guān)注，必要時(shí)與臨床溝通后再發(fā)放NGS檢測(cè)報(bào)告單。有時(shí)測(cè)序到的序列數(shù)較低，但結(jié)果對(duì)臨床亦有一定提示作用。

4.5報(bào)告解讀的基本原則

4.5.1檢測(cè)到病原體的分級(jí)解讀 高等級(jí)的致病性病原體如結(jié)核分枝桿菌、新型隱球菌等，在大部分類型樣本中均可能是病原體。中等級(jí)的條件致病菌如念珠菌屬，在外周血、腦脊液、穿刺液等無(wú)菌體液樣本中可能是病原體，但在痰液、肺泡灌洗液、尿液中可能是共生菌，需結(jié)合臨床特征慎重判斷致病可能性。低等級(jí)的條件致病菌如凝固酶陰性葡萄球菌，在外周血、痰液、肺泡灌洗液、尿液等大部分樣本類型中可能是共生菌，只在少數(shù)情況下如侵入操作后的腦脊液/外周血樣本、感染性心內(nèi)膜炎的贅生物樣本中可能致病。不排除疑似背景列表中的微生物引起感染，在某些感染樣本類型中能與低等級(jí)的條件致病菌相互轉(zhuǎn)化。因mNGS技術(shù)檢測(cè)感染性病原體為定性檢測(cè)，不能區(qū)分是否為優(yōu)勢(shì)菌，故對(duì)于某些開放性樣本的診斷價(jià)值應(yīng)持慎重態(tài)度。

4.5.2序列數(shù)的解讀 序列數(shù)需結(jié)合致病性、患者臨床特征，判斷該病原體致病的可能性。在同一大類中，如某物種的序列數(shù)和其他物種有數(shù)量級(jí)的差異，則考慮其豐度較高，致病可能性相應(yīng)增加。同一患者同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的報(bào)告中出現(xiàn)相同的病原體，尤其是一個(gè)樣本為外周血，另一個(gè)樣本為病灶部位時(shí)，共同檢出的病原體致病可能性較高。

4.5.3未檢測(cè)到病原體的解讀 在確保檢測(cè)流程、質(zhì)量控制均合格的情況下，未檢出病原體可分為2種情況。一是檢測(cè)結(jié)果無(wú)病原體檢出，但存在較多疑似背景微生物，通常出現(xiàn)在痰液、肺泡灌洗液等本身存在微生態(tài)的樣本類型中，這種報(bào)告解讀建議著重關(guān)注患者基本信息及跟進(jìn)最新臨床病情，綜合判斷排除感染的可能性。二是檢測(cè)結(jié)果和疑似背景微生物列表均無(wú)檢出，考慮樣本采集時(shí)機(jī)不合適(如采樣時(shí)正在使用抗菌藥物)，采集的樣本不能反映感染病灶情況(如肺部感染，而采集的標(biāo)本為外周血)；在腦脊液、外周血等無(wú)菌體液樣本中，該報(bào)告可提示排除感染；在痰液、肺泡灌洗液等本身存在微生物的樣本報(bào)告中，必須重新回溯檢測(cè)流程和質(zhì)控，必要時(shí)從樣本核酸提取開始重新檢測(cè)和復(fù)核。

4.5.4罕見病原體、胞內(nèi)菌等特殊病原體的解讀 在結(jié)果解讀時(shí)需回溯生物信息分析結(jié)果，很可能因?yàn)闃颖局械暮康?、胞?nèi)釋放未完全、核酸提取效率低等原因低于報(bào)告閾值而未列舉在檢測(cè)報(bào)告中，提示對(duì)于胞內(nèi)、破壁困難的微生物設(shè)置應(yīng)調(diào)整報(bào)告閾值，對(duì)于罕見病原體需要結(jié)合臨床病史和臨床溝通后再報(bào)告。

4.5.5DNA和RNA同時(shí)檢出的解讀 DNA反映樣本中存在病原體DNA，但不能區(qū)分病原體的存活狀態(tài)；RNA反映病原體轉(zhuǎn)錄水平，可提示病原體在采集樣本中的轉(zhuǎn)錄活性，提示病原體的活躍度。DNA 和RNA 報(bào)告中同時(shí)檢出的病原體其致病可能性更高。

4.5.6報(bào)告時(shí)間

共識(shí)16：由于mNGS技術(shù)檢測(cè)感染性病原體，對(duì)于重癥疾病、復(fù)發(fā)感染、不明原因發(fā)熱、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、異基因造血干細(xì)胞移植和器官移植后感染等患者臨床診斷，具有重要的提示價(jià)值和優(yōu)勢(shì)，故推薦在48～72 h內(nèi)完成檢測(cè)并發(fā)放mNGS報(bào)告單。

5 展望

mNGS技術(shù)已經(jīng)逐步向著成熟化的臨床病原體檢測(cè)應(yīng)用方向發(fā)展，其臨床應(yīng)用價(jià)值在不斷提高的同時(shí)，仍存在需進(jìn)一步優(yōu)化的方面。技術(shù)層面，如mNGS檢測(cè)結(jié)果無(wú)法完全區(qū)分致病和定植病原體，不同的病原體的mNGS檢測(cè)報(bào)告的閾值如何確定，人源核酸去除技術(shù)對(duì)最終NGS檢測(cè)結(jié)果的影響等，都需要在大數(shù)據(jù)層面進(jìn)行一定的劃分和進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于病原體耐藥的預(yù)測(cè)方面，目前的難點(diǎn)為耐藥基因無(wú)法精確定位到具體的病原體，以及耐藥基因的存在和耐藥表型一致性問(wèn)題，也是mNGS技術(shù)下一步亟需突破的方向之一。生物信息層面，病原體全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、分析軟件都需要不斷完善及實(shí)時(shí)更新、升級(jí)。此外，實(shí)驗(yàn)室從事mNGS病原體檢測(cè)項(xiàng)目的性能確認(rèn)和質(zhì)量保證體系的建設(shè)尚待完善，目前國(guó)內(nèi)外權(quán)威認(rèn)證機(jī)構(gòu)尚無(wú)mNGS病原體檢測(cè)相關(guān)指南或指導(dǎo)原則的發(fā)布，需要多專業(yè)的人員合作才能完成。因此，本專家共識(shí)的建立需要在今后的臨床檢測(cè)工作中進(jìn)一步完善和更新，以期推動(dòng)本省乃至全國(guó)NGS技術(shù)在感染性病原體疾病診斷中的臨床應(yīng)用。

執(zhí)筆：何軍。

終審：許斌、趙建華。

參與本共識(shí)修訂的人員及單位(按姓名拼音順序排列)：

杜鴻(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院)、顧兵(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)、何軍(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)、韓崇旭(蘇北人民醫(yī)院)、李麗(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)、李曉軍(中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)、林寧(淮安市第一人民醫(yī)院)、梁偉(連云港市第二人民醫(yī)院)、劉佳(南京世和基因生物技術(shù)公司)、鞠少卿(南通大學(xué)附屬醫(yī)院)、姜玉章(淮安市第一人民醫(yī)院)、居會(huì)祥(鹽城市第三人民醫(yī)院)、馬萍(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)、馬達(dá)(鹽城市第一人民醫(yī)院)、牛國(guó)平(徐州市中心醫(yī)院)、潘世揚(yáng)(江蘇省人民醫(yī)院)、錢暉(江蘇大學(xué))、沈翰(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院)、史偉峰(常州市第一人民醫(yī)院)、汪俊軍(中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)、王書奎(南京市第一醫(yī)院)、王麗(徐州市第一人民醫(yī)院)、王春新(無(wú)錫市第一人民醫(yī)院)、吳元健(蘇州市市立醫(yī)院)、吳國(guó)球(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院)、許斌(江蘇省臨床檢驗(yàn)中心)、許文榮(江蘇大學(xué))、徐杰(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)、陰晴(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院)、姚永良(昆山市第一人民醫(yī)院)、楊辰(蘇州市市立醫(yī)院)、趙建華(江蘇省臨床檢驗(yàn)中心)、朱葉飛(南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)、朱雪明(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院)、張平(常州市第二人民醫(yī)院)、張憲(南京世和基因生物技術(shù)公司)、鄒榮良(無(wú)錫市第二人民醫(yī)院)、周成林(泰州市人民醫(yī)院)、周鵬(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)。