袁超，金娜

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430015；2.武漢市江夏區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，武漢 430000)

膿毒癥是由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，其主要臨床特征為全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈RNA分子，可以調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，影響疾病的發(fā)生、發(fā)展。有學(xué)者認(rèn)為，某些LncRNA是膿毒癥的良好診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者循環(huán)LncRNANEAT1與疾病風(fēng)險(xiǎn)增加、嚴(yán)重程度升高、預(yù)后不良以及促炎細(xì)胞因子的高表達(dá)密切相關(guān)[2]。LncRNA 母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)是一種抑癌基因。Chen等[3]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAMEG3在膿毒癥中呈高表達(dá)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，下調(diào)LncRNAMEG3表達(dá)可抑制腎臟和心臟等主要器官的細(xì)胞凋亡，LncRNAMEG3可能成為膿毒癥的潛在治療靶點(diǎn)。此外，LncRNAMEG3還被證實(shí)與感染和炎癥相關(guān)疾病的進(jìn)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，被分枝桿菌感染后，巨噬細(xì)胞中LncRNAMEG3的表達(dá)水平降低，并可通過(guò)自噬消除分枝桿菌[4-5]。但目前關(guān)于LncRNAMEG3對(duì)膿毒癥患者預(yù)后等方面的研究較少。因此，本研究旨在檢測(cè)LncRNAMEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)水平，分析其臨床意義，以期為膿毒癥患者的診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2017年1月至2019年10月湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的膿毒癥患者65例，男29例，女36例，年齡(49.8±12.3)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合2016年由美國(guó)重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(SCCM)與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(huì)(ESICM)聯(lián)合發(fā)布的《膿毒癥3.0定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]；(2)年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有各類腫瘤、慢性腎臟疾病、燒傷、急性胰腺炎、72 h內(nèi)有創(chuàng)傷或手術(shù)經(jīng)歷的患者。本研究共納入一般膿毒癥18例，嚴(yán)重膿毒癥24例，膿毒癥休克23例；急性生理學(xué)及慢性健康狀況(APACHE Ⅱ)評(píng)分為輕度16例，中度30例，重度19例；無(wú)凝血功能障礙25例，凝血功能障礙糾正16例，凝血功能障礙未糾正24例。另選擇同期于我院就診的體檢健康者65例作為健康人對(duì)照組，男31例，女34例，年齡(50.2±12.5)歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究通過(guò)湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)[No. 2016倫審科字第(52)號(hào)]，患者均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Mini-Protean3電泳分析儀、GELDOC 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Multiskan FC全自動(dòng)酶聯(lián)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，Allegra X-64R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3標(biāo)本采集 采集各患者入院時(shí)(體檢健康者于體檢時(shí)采集)的空腹靜脈血3 mL，4 ℃、950×g離心15 min，收集血漿，15 130×g離心15 min，去除細(xì)胞碎片，置于-80 ℃保存。

1.4RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 采用Trizol試劑提取血漿標(biāo)本中的總RNA，用Multiskan FC全自動(dòng)酶聯(lián)儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，取吸光度 (A260/280 nm)為1.8～2.0的標(biāo)本,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20 ℃保存。

1.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR LncRNAMEG3及內(nèi)參GAPDH的引物序列根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，由上海生工公司采用Primerbank引物設(shè)計(jì)軟件(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)設(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括: SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水補(bǔ)足至20 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)參數(shù):95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 55 s；共35個(gè)循環(huán)。使用Step OneTM軟件在60 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)并進(jìn)行熔解曲線分析，LncRNAMEG3的表達(dá)水平以2-ΔΔCt法計(jì)算，公式: ΔΔCt=[(實(shí)驗(yàn)組Ct目的基因-實(shí)驗(yàn)組Ct內(nèi)參基因)- (對(duì)照組Ct目的基因-對(duì)照組Ct內(nèi)參基因)]。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1各組LncRNAMEG3表達(dá)水平比較結(jié)果 LncRNAMEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)水平(3.94±0.71)較健康人對(duì)照組(2.50±0.15)顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.064，P<0.05)；進(jìn)一步進(jìn)行亞組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥休克患者LncRNAMEG3的表達(dá)水平較嚴(yán)重膿毒癥及一般膿毒癥均明顯升高(P<0.05)；APACHE Ⅱ評(píng)分為重度患者較中度及輕度患者顯著升高(P<0.05)；凝血功能障礙未糾正患者較凝血功能障礙糾正患者及無(wú)凝血功能障礙患者顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2LncRNAMEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 LncRNAMEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者病情嚴(yán)重程度、APACHE Ⅱ評(píng)分以及凝血功能障礙是否糾正的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為13.819、15.186和9.639，P均<0.01)；而與患者年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組患者血漿中LncRNA MEG3的表達(dá)水平

2.3LncRNAMEG3表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier分析結(jié)果表明，LncRNAMEG3高表達(dá)膿毒癥患者的30 d存活率為26.47%(9/34)，顯著低于低表達(dá)者的70.97%(22/31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.953，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表3 LncRNA MEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

作為固有免疫反應(yīng)的一個(gè)組成部分，LncRNA可以抑制和促進(jìn)炎癥信號(hào)。LncRNA在自身免疫病中可導(dǎo)致基因的異常表達(dá)，參與炎癥性疾病的進(jìn)展[8]。LncRNAMEG3具有良好的腫瘤標(biāo)志物功能。然而，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于LncRNAMEG3與膿毒癥患者病理因素及預(yù)后情況的關(guān)系研究少見(jiàn)。本研究結(jié)果表明，LncRNAMEG3在膿毒癥患者血漿中的表達(dá)水平較健康人對(duì)照組顯著升高，與Na等[9]研究結(jié)果相似；其研究還發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者血漿LncRNAMEG3高表達(dá)可增強(qiáng)炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和釋放，從而導(dǎo)致組織的損傷和壞死，加速器官損傷、多器官功能衰竭，并能通過(guò)與miR-21相互作用，成為膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。此外，本研究與Chen等[3]的研究結(jié)果均提示LncRNAMEG3可作為膿毒癥患者預(yù)后預(yù)測(cè)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究回顧性分析了LncRNAMEG3表達(dá)水平與膿毒癥患者臨床病理參數(shù)及30 d存活率的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNAMEG3高表達(dá)與患者病情嚴(yán)重程度、APACHE Ⅱ評(píng)分以及凝血功能障礙是否糾正等差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)一步進(jìn)行亞組間比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥休克患者、APACHE Ⅱ評(píng)分為重度患者或凝血功能障礙未糾正患者血漿 LncRNAMEG3的表達(dá)水平均顯著升高，提示LncRNAMEG3高表達(dá)可能與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。此外，LncRNAMEG3高表達(dá)膿毒癥患者30 d存活率較低表達(dá)患者顯著降低，提示LncRNAMEG3高表達(dá)與膿毒癥患者高死亡率存在密切關(guān)系。以上結(jié)果表明，LncRNAMEG3可作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，通過(guò)下調(diào)LncRNAMEG3的表達(dá)以發(fā)揮臨床治療膿毒癥的功效。

細(xì)胞凋亡是膿毒癥和嚴(yán)重?fù)p傷(如燒傷、大手術(shù)和創(chuàng)傷)的常見(jiàn)過(guò)程，這一過(guò)程發(fā)生在損傷的早期。細(xì)胞凋亡調(diào)控是危重病患者治療研究的一個(gè)新熱點(diǎn)[10-11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重膿毒癥和感染性休克患者細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞增加[12]。Lu等[13]研究表明，LncRNAMEG3在癌癥及敗血癥患者中分別表現(xiàn)為下調(diào)與上調(diào)的表達(dá)模式，但其在兩者中均發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；LncRNAMEG3可能與p53相互作用，發(fā)揮調(diào)節(jié)癌細(xì)胞凋亡的功能。提示LncRNAMEG3可能通過(guò)類似的機(jī)制參與了膿毒癥的發(fā)病，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，LncRNAMEG3與患者病情及預(yù)后關(guān)系密切，可能作為膿毒癥臨床治療靶點(diǎn)與預(yù)后預(yù)測(cè)因子，為膿毒癥的臨床防治提供新思路。然而，本研究尚存在以下不足之處：(1)病例數(shù)較少，后期需擴(kuò)大樣本量對(duì)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證及補(bǔ)充；(2)缺乏相關(guān)機(jī)制作用研究，今后擬通過(guò)動(dòng)物及體外實(shí)驗(yàn)深入探討LncRNAMEG3在膿毒癥中的作用機(jī)制。