蔣璐西，葛世軍，番云華，楊必清，易薇，黃鎧，褚嘉祐，楊昭慶

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所遺傳室，昆明 650118； 2.云南德宏傣族景頗族自治州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南芒市 678402)

Hb G-Taipei指由于β珠蛋白基因(HBB)第68位堿基發(fā)生點(diǎn)突變(A>G)導(dǎo)致β珠蛋白第22位氨基酸發(fā)生改變(Glu>Gly)，從而引起異常血紅蛋白病[1]。一項(xiàng)病例報(bào)道表明,單純Hb G-Taipei雜合突變不產(chǎn)生明顯的臨床癥狀，但在合并β地中海貧血時(shí)可加重貧血癥狀[2]。目前對(duì)Hb G-Taipei臨床表型的病例報(bào)道較少且多集中于雜合子，而純合子及復(fù)合突變患者的臨床表現(xiàn)尚不明確，臨床上迫切需要這些基因變異的檢驗(yàn)學(xué)和臨床表型數(shù)據(jù)以指導(dǎo)診治、產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢。云南是我國(guó)異常血紅蛋白病和地中海貧血的高發(fā)地區(qū)，珠蛋白基因復(fù)合突變產(chǎn)生復(fù)雜血液學(xué)表型的情況時(shí)有發(fā)生[3-4]。本研究通過(guò)對(duì)云南德宏地區(qū)3個(gè)無(wú)親緣關(guān)系漢族家系中的7例患者進(jìn)行分析，報(bào)道1例Hb G-Taipei純合子的表型特征，分析Hb G-Taipei突變合并-α3.7地貧突變的臨床表現(xiàn)，同時(shí)通過(guò)HBB基因簇的單倍型分析揭示云南漢族Hb G-Taipei突變的可能起源，以期為異常血紅蛋白Hb G-Taipei病的臨床診斷及遺傳咨詢提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 回顧性分析2018年8月至2019年12月于云南省德宏傣族景頗族自治州人民醫(yī)院行產(chǎn)前檢查且經(jīng)血紅蛋白電泳檢出異常血紅蛋白電泳條帶D(Hb D)的患者。根據(jù)篩查結(jié)果進(jìn)行家系分析和基因診斷。經(jīng)β珠蛋白基因Sanger測(cè)序共確證7例攜帶Hb G-Taipei突變的患者，男3例，女4例，年齡0.6～64歲，中位年齡30歲，均來(lái)自云南德宏地區(qū)，且為漢族，其中5例來(lái)自1個(gè)先證者家系(家系圖譜見圖1)，另外2例來(lái)自相互無(wú)親緣關(guān)系的家庭。本研究通過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.2016-01)，患者或家屬知情同意。

1.2主要儀器及試劑 XT-1800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本Sysmex公司)，CAPILLARYS全自動(dòng)血紅蛋白電泳系統(tǒng)(法國(guó)Sebia公司)，Magpix液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)(美國(guó)Luminex公司)，5417R/5810R離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)，ND-1000分光光度計(jì)(美國(guó)Nanodrop公司)，ABI 9700 PCR儀、PRISM 3730xl DNA測(cè)序儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)，Wide Mini-Sub Cell GT system核酸電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，GelVue UV transilluminator凝膠成像儀(英國(guó)Synoptics公司)。全血基因組 DNA 提取試劑盒(美國(guó)Axygen公司)，地中海貧血(α/β)基因檢測(cè)試劑盒(廣州達(dá)安基因公司)，LA Taq DNA聚合酶試劑盒(日本TaKaRa公司)，HincⅡ、HindⅢ、AvaⅡ和HinfⅠ限制性內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司)。

1.3標(biāo)本采集 采集各研究對(duì)象就診時(shí)的空腹靜脈血2.5 mL，EDTA-K2抗凝， 4 ℃保存。200 μL用于DNA提取和基因分析。其余血標(biāo)本部分用于血常規(guī)檢測(cè)；另一部分經(jīng)5 000 r/min離心5 min去除血漿，10倍體積生理鹽水洗滌紅細(xì)胞2次后進(jìn)行血紅蛋白電泳分析。

1.4血液學(xué)表型分析 采用XT-1800i全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其配套試劑檢測(cè)EDTA-K2抗凝靜脈血標(biāo)本中血紅蛋白含量(Hb)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCH)等各項(xiàng)紅細(xì)胞參數(shù)。各指標(biāo)參考范圍[5]：MCV≥80 fL，MCH≥27 pg，Hb≥120 g/L(成年男性)，Hb≥110 g/L(成年女性)，Hb≥100 g/L(6個(gè)月齡以下幼兒)，Hb≥110 g/L(7個(gè)月～6歲兒童)。采用CAPILLARYS全自動(dòng)血紅蛋白電泳系統(tǒng)及配套試劑進(jìn)行HbA2、HbA等血紅蛋白電泳參數(shù)檢測(cè)。參考范圍：HbA>94.5%，HbF<2.0%，HbA22.0%～3.5%。出現(xiàn)HbE、HbJ、HbD、HbK和HbH等異常電泳條帶時(shí)提示有血紅蛋白變異體存在，進(jìn)一步行β珠蛋白和α珠蛋白基因檢測(cè)。

1.5珠蛋白基因分析

1.5.1α/β珠蛋白基因檢測(cè) 采用全血基因組 DNA 提取試劑盒從外周抗凝血樣本中提取DNA，采用ND-1000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，取吸光度(A260/280 nm)在1.7～1.9之間的樣本，短期保存置于4 ℃，長(zhǎng)期保存置于-20 ℃。采用PCR-流式熒光雜交法，地中海貧血(α/β)基因檢測(cè)試劑盒和Magpix液態(tài)懸浮芯片系統(tǒng)檢測(cè)α珠蛋白基因常見的3種缺失型突變(--SEA、-α3.7、-α4.2)、3種點(diǎn)突變(αWSα、αCSα、αQSα)以及17種常見的β珠蛋白基因突變(-28、-29、-30，-32、 CD14-15、CD17、CD26、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、Int、 IVS-1-1、IVS-1-5、IVS-2-654和Cap)。結(jié)果均按照試劑盒說(shuō)明書判讀。

1.5.2HBB基因片段擴(kuò)增 以HBB基因( NC_000011.10,GRCh38.p13)序列為模板，采用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)primer-blast工具在線設(shè)計(jì)引物，UCSC(http://genome.ucsc.edu/)In-Silico PCR工具驗(yàn)證引物的特異性。上游引物序列：5′-TGGTATGGGGCCAAGAGATA-3′，Tm 60.3 ℃；下游引物序列：5′-TTTGCAGCCTCACCTTCTTT-3′,Tm 60.0 ℃；產(chǎn)物1 973 bp。通過(guò)LA Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增HBB基因，擴(kuò)增體系為30 μL，包含10 μmol/L上、下游引物各0.3 μL，10×GC buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTPs 3 μL，LA Taq 1.5 U，DNA模板約80 ng，ddH2O補(bǔ)足至30 μL。循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，38次循環(huán);72 ℃延伸20 min。

1.5.3HBB基因簇單倍型分析 采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)方法檢測(cè)HBB基因簇上7個(gè)多態(tài)性酶切位點(diǎn)的基因型，從基因簇5′端到3′端方向的位點(diǎn)依次為HincⅡ-ε、HindⅢ-Gγ、HindⅢ-Aγ、HincⅡ-5′ψβ、HincⅡ-3ψβ、AvaⅡ-β和HinfⅠ-β，PCR引物及反應(yīng)體系與限制酶切反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。根據(jù)HBB基因簇上是否存在相應(yīng)限制性酶切位點(diǎn)判斷基因型，“+”表示存在該限制性位點(diǎn)，“-”表示不存在該限制性位點(diǎn)，通過(guò)基因型推斷單倍型。當(dāng)HBB基因簇多態(tài)性位點(diǎn)的基因型為雜合狀態(tài)時(shí)，若缺乏病例家系中其他直系親屬的基因型，不能確定單倍型中該位點(diǎn)的等位基因型，則該位點(diǎn)的基因型以“*”表示。

2 結(jié)果

2.1血液學(xué)表型分析結(jié)果 7例Hb G-Taipei患者中，1例(患者1)MCV<80 fL，有輕微小細(xì)胞表現(xiàn)但無(wú)貧血等癥狀；1例(患者5)呈輕度小細(xì)胞低色素貧血，該患者骨髓鐵染色陰性，有缺鐵可能；1例(患者6)呈輕度貧血，但無(wú)小細(xì)胞低色素表現(xiàn)，且無(wú)缺鐵表現(xiàn)(血清鐵蛋白168 ng/mL)；其余患者Hb、MCV、MCH均在正常水平，結(jié)果見表1。患者4(Hb G-Taipei純合子)血紅蛋白電泳未檢出HbA，電泳結(jié)果出現(xiàn)定位區(qū)帶HbA消失的現(xiàn)象，檢出含量為96.3%的異常血紅蛋白條帶HbD(圖2A)。其余患者(Hb G-Taipei雜合子)血紅蛋白電泳結(jié)果相似，異常Hb D帶含量為37.0%～40.2%，結(jié)果見圖2B。

表1 Hb G-Taipei家系及2例無(wú)親緣關(guān)系的Hb G-Taipei病例的血液學(xué)表型與基因型

2.2珠蛋白基因突變檢測(cè)結(jié)果 各研究對(duì)象的基因檢測(cè)結(jié)果見表1。7例Hb D異常電泳條帶的患者行常規(guī)地貧基因檢測(cè),均未發(fā)現(xiàn)常見β地貧基因突變類型，有3例檢測(cè)出攜帶缺失型α地貧基因(-α3.7)。PCR-DNA測(cè)序結(jié)果顯示,患者HBB基因均檢測(cè)出HBBc.68A>G(p.Glu22Gly)突變，在血紅蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Hb Var中該突變?yōu)镠b G-Taipei。其中1例為純合子(圖3A)，其余6例為雜合子(圖3B)。

2.3單倍型分析結(jié)果 7例Hb G-Taipei患者的HBB基因簇多態(tài)位點(diǎn)單倍型結(jié)果見表1。通過(guò)家系分析，5例患者組成的家系中Hb G-Taipei突變與[------+]單倍型連鎖。患者6也攜帶[------+]單倍型，Hb G-Taipei突變可能與該單倍型連鎖。而患者7由于缺乏家庭成員信息，不能完成分析，但其3′端AvaⅡ-β和HinfⅠ-β 2個(gè)位點(diǎn)為[-+]，與其余患者相同。

3 討論

Hb G-Taipei及其他多種異常血紅蛋白可干擾糖尿病的檢測(cè)[7-8]，因此檢測(cè)異常血紅蛋白在臨床檢驗(yàn)工作中具有重要的輔助診斷作用。Hb G-Taipei的臨床鑒定主要通過(guò)血紅蛋白電泳，以出現(xiàn)異常Hb D帶為主要特征[2,9-10]。本研究中Hb G-Taipei患者檢出異常Hb D帶，雜合子電泳特征存在37.0%～40.2%異常Hb D帶，與既往的報(bào)道結(jié)果相似。合并-α3.7突變之后無(wú)明顯變化，說(shuō)明-α3.7突變的存在對(duì)Hb G-Taipei突變產(chǎn)生的異常血紅蛋白含量無(wú)影響。本研究檢測(cè)并分析了純合突變的Hb G-Taipei血液學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白相對(duì)含量達(dá)到96.3%，同時(shí)由于此例純合子合并-α3.7突變，導(dǎo)致HbA四聚體(α2β2)不能合成，血紅蛋白電泳系統(tǒng)無(wú)法根據(jù)HbA對(duì)各組電泳條帶進(jìn)行自動(dòng)定位，從而使得定位區(qū)帶消失，類似定位區(qū)帶消失的情況在復(fù)合型異常血紅蛋白中也有發(fā)生[3-4,11]。

單純雜合Hb G-Taipei突變通常不產(chǎn)生血液學(xué)改變[2,9]。本研究中Hb G-Taipei雜合子患者的臨床表現(xiàn)由無(wú)癥狀至輕度貧血，與之前的報(bào)道存在共性及差異。雜合子中(患者5)輕度小細(xì)胞低色素貧血患者伴有缺鐵癥狀，可能是缺鐵和Hb G-Taipei單獨(dú)或共同作用產(chǎn)生的相應(yīng)表型。另1例輕度貧血(患者6)無(wú)小細(xì)胞低色素和缺鐵癥狀，推測(cè)可能是營(yíng)養(yǎng)狀況和生理周期等多種因素共同引起的貧血癥狀。純合子表現(xiàn)為無(wú)貧血癥狀，提示Hb G-Taipei純合子與雜合子功能相似。靜止型α地貧(-α3.7/αα)和Hb G-Taipei突變單獨(dú)作用時(shí)不產(chǎn)生明顯血液學(xué)表型[9,12]，本研究顯示二者復(fù)合突變時(shí)亦不產(chǎn)生貧血癥狀。盡管Hb G-Taipei合并-α3.7時(shí)無(wú)明顯臨床血液學(xué)改變，但在遺傳性血紅蛋白病高發(fā)的云南地區(qū)，極易合并其他血紅蛋白突變而產(chǎn)生較重的貧血癥狀，因此對(duì)Hb G-Taipei以及其他異常血紅蛋白進(jìn)行臨床篩查和基因檢測(cè)在血紅蛋白病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中仍非常有必要。

本研究在3個(gè)漢族家系中檢出Hb G-Taipei，其中2個(gè)家系存在共同單倍型[------+]，提示Hb G-Taipei突變可能與該單倍型連鎖。同時(shí)檢出的所有Hb G-Taipei患者的HBB基因簇單倍型存在相同的3′端[-+]，由此推測(cè)云南漢族的Hb G-Taipei突變可能有共同來(lái)源。既往報(bào)道表明，Hb G-Taipei突變主要發(fā)生于漢族和北方少數(shù)民族[13]。根據(jù)云南漢族的遷移信息，推測(cè)本研究中的Hb G-Taipei突變可能來(lái)源于北方漢族。但由于樣本數(shù)量較少，且缺乏其他地區(qū)和民族的單倍型數(shù)據(jù)，不能確定Hb G-Taipei突變的源流。

綜上所述，本研究對(duì)Hb G-Taipei以及合并α地貧病例的臨床表征進(jìn)行分析，為血紅蛋白疾病篩查、基因診斷和遺傳咨詢提供了更多參考依據(jù)，并初步揭示了云南德宏地區(qū)Hb G-Taipei突變的源流。然而本研究總體樣本較少，需要積累更多病例資料，以探討Hb G-Taipei突變與缺鐵及其他血紅蛋白病的相互影響，為血紅蛋白疾病診治和防控提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。