王杰，董弘，武麗瓊，郭志遠(yuǎn)，安槿，張麗春，徐睿廷，王曉華，賈躍旗

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院a.遺傳優(yōu)生科，b.超聲醫(yī)學(xué)科，呼和浩特010020；2.內(nèi)蒙古大學(xué)省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010021)

1997年盧煜明等[1]發(fā)現(xiàn)母體血漿中存在胎兒游離DNA(cffDNA)，為胎兒染色體非整倍體的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal screening, NIPS)開(kāi)辟了新的方向。與傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查相比，NIPS具有更高的敏感性和特異性。一項(xiàng)薈萃(meta)分析結(jié)果表明，NIPS對(duì)于T21、T18和T13的檢出率分別為99.0%、96.80%和92.1%，假陽(yáng)性率分別為0.08%、0.15%和 0.2%[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，部分假陰性結(jié)果與低胎兒濃度和嵌合體有關(guān)，但也有一些病例尚未得到解釋[3]。由于假陰性更容易引起臨床誤診，因此研究假陰性的原因具有重要的臨床意義。

本研究對(duì)3例經(jīng)NIPS檢測(cè)結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)，后經(jīng)產(chǎn)前及產(chǎn)后跟蹤分析診斷為假陰性的病例進(jìn)行回顧性分析及進(jìn)一步的檢測(cè)，評(píng)估NIPS發(fā)生假陰性的影響因素，并對(duì)比不同測(cè)序平臺(tái)及加大測(cè)序深度后對(duì)假陰性樣本的檢出效果，總結(jié)NIPS在臨床應(yīng)用中的局限性，為檢測(cè)低風(fēng)險(xiǎn)孕婦的遺傳咨詢和臨床管理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年7月至2019年7月在內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院行NIPS檢測(cè)提示為低風(fēng)險(xiǎn)的19 242例孕婦，年齡18～47歲，中位年齡32歲，孕周12～37周，平均孕周19周；所有孕婦在1年之內(nèi)無(wú)輸血、移植、免疫治療等異體細(xì)胞輸入史。后經(jīng)本院遺傳優(yōu)生科產(chǎn)前及產(chǎn)后染色體核型分析診斷為假陰性病例3例。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.2019-007-1)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器及試劑 Sorvall ST16R 冷凍離心機(jī)、Qubit3.0熒光定量?jī)x、Ion Proton高通量測(cè)序儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)，GSL-120全自動(dòng)染色體核型分析系統(tǒng)(德國(guó)Laica公司)，Agena MassARRAY飛行時(shí)間質(zhì)譜、COMPLETE GENOTYPING REAGENT SET檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Agena公司)，QIAamp DNA Blood Mini Kit(德國(guó)Qiagen公司)，胎兒染色體非整倍體21三體、18三體和13三體檢測(cè)試劑盒(半導(dǎo)體測(cè)序法，中山大學(xué)達(dá)安基因公司)，MGISEQ-500測(cè)序儀、胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法)、染色體拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)檢測(cè)試劑盒、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法)均購(gòu)自武漢華大基因科技公司，真空采血管(北京康為世紀(jì)公司)。

1.3妊娠管理 NIPS檢測(cè)為低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦經(jīng)遺傳咨詢并進(jìn)行孕期超聲跟蹤，如胎兒超聲檢查提示異常人群，于孕18～22周借助于羊膜腔穿刺技術(shù)獲得羊水細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析，>23周者用臍靜脈穿刺技術(shù)采集臍帶血進(jìn)行染色體核型分析。孕期無(wú)異常者持續(xù)跟蹤至胎兒出生，如發(fā)現(xiàn)特殊面容或符合T21、T18或T13超聲異常指征的新生兒，采集外周血進(jìn)行染色體核型分析檢測(cè)，并對(duì)其孕期影像學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。

1.4假陰性樣本的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制

1.4.1樣本混樣排查 對(duì)樣本送檢單、知情同意書(shū)、檢測(cè)過(guò)程的原始記錄及質(zhì)控記錄進(jìn)行整體回顧，核對(duì)送檢單上樣本編號(hào)、姓名的一致性，同時(shí)回顧同批次送檢樣本檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估混樣可能。使用備份白細(xì)胞樣本、備份血漿文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，評(píng)估檢測(cè)樣本與備份白細(xì)胞樣本的一致性。

1.4.2備份樣本復(fù)測(cè) 啟用備份血漿采用相同的方法進(jìn)行二次復(fù)測(cè)，評(píng)估2次檢測(cè)結(jié)果的一致性；更換不同檢測(cè)試劑盒，使用Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估檢測(cè)方法、測(cè)序儀、數(shù)據(jù)算法的一致性；使用擴(kuò)展性無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPS-Plus)增加測(cè)序量(有效數(shù)據(jù)量≥25 M)、提高測(cè)序深度、優(yōu)化算法評(píng)估檢測(cè)結(jié)果的一致性。

1.4.3母體背景排查 使用備份母體白細(xì)胞進(jìn)行染色體微缺失微重復(fù)檢測(cè)(CNV-Seq)，排查母體存在微缺失或微重復(fù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1.4.4胎盤(pán)嵌合排查 采集假陰性病例胎盤(pán)樣本，提取基因組DNA進(jìn)行CNV-Seq，對(duì)胎盤(pán)組織中染色體情況進(jìn)行排查。

1.5NIPS(Complete Genomics測(cè)序平臺(tái)) 空腹抽取孕婦孕期外周靜脈血5 mL，置于游離DNA專(zhuān)用真空采血管(EDTA-K2抗凝)中，按照本實(shí)驗(yàn)室建立的NIPS標(biāo)準(zhǔn)化操作方法[4]進(jìn)行，經(jīng)4 ℃、1 600×g離心10 min，取上清液，16 000×g離心10 min去沉淀，收集血漿置于-20 ℃暫存，后轉(zhuǎn)入-80 ℃長(zhǎng)期保存。應(yīng)用聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法，按照胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，并借助于BGI500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，利用高分辨率成像系統(tǒng)及生物信息系統(tǒng)轉(zhuǎn)換得到待測(cè)序列。所得序列經(jīng)與人參考基因組(如GRCh37/hg19)比對(duì)，確定每一測(cè)序reads染色體的定位，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)化Z值。綜合運(yùn)用Y染色體估算法和seqFF估算法，評(píng)估樣本中胎兒游離DNA比例[5]。當(dāng)樣本滿足度量標(biāo)準(zhǔn)(有效數(shù)據(jù)量≥3.5 M，無(wú)擴(kuò)增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化Z值評(píng)估檢測(cè)結(jié)果，若Z值的絕對(duì)值≥3，提示高風(fēng)險(xiǎn)；Z值介于±3之間，結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)。

1.6NIPS (Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范及本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)規(guī)程[4]進(jìn)行操作，獲得定量后的文庫(kù)，單個(gè)樣本終濃度為100 pmol/L，獲得pooling文庫(kù)，再經(jīng)過(guò)乳液PCR擴(kuò)增并上機(jī)測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)。經(jīng)數(shù)據(jù)分析后得出最終標(biāo)準(zhǔn)化Z值，采用DNA片段大小估算胎兒DNA濃度[6]，當(dāng)樣本滿足度量標(biāo)準(zhǔn)(有效數(shù)據(jù)量≥3.0 M，無(wú)擴(kuò)增偏倚，cffDNA比例≥5%)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化Z值評(píng)估檢測(cè)結(jié)果，若Z值的絕對(duì)值≥3，提示高風(fēng)險(xiǎn)；Z值介于±3之間，結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)。

1.7NIPS-Plus檢測(cè) 按照胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法)說(shuō)明書(shū)操作，采用BGI500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)高分辨率成像系統(tǒng)采集光信號(hào)，光信號(hào)經(jīng)過(guò)數(shù)字化處理后，使用RUPA算法將原始reads比對(duì)至hg19/GRCh37參考基因組，經(jīng)數(shù)據(jù)分析后得出最終標(biāo)準(zhǔn)化Z值，樣本滿足度量標(biāo)準(zhǔn)(有效數(shù)據(jù)量≥25 M，無(wú)擴(kuò)增偏倚，cffDNA比例≥3.5%)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化Z值評(píng)估檢測(cè)結(jié)果，若Z值的絕對(duì)值≥3，提示高風(fēng)險(xiǎn)；Z值介于±3之間，結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)。

1.8臍靜脈穿刺與外周血染色體核型分析 在超聲引導(dǎo)下無(wú)菌采集>23周的孕婦臍帶血2 mL(肝素抗凝)，采集新生兒靜脈血2 mL(肝素抗凝)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范及本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化臍帶血/外周血培養(yǎng)規(guī)程[7]進(jìn)行操作，使用Trypsin-Giemsa染色法制備染色體G帶。Leica GSL-120全自動(dòng)掃描顯微鏡和圖像分析系統(tǒng)觀察高倍顯微鏡下每份樣品至少50個(gè)中期相(400～500帶分辨率水平)，如果有嵌合現(xiàn)象，增加計(jì)數(shù)分裂相至100個(gè)。根據(jù)人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN)2016版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析診斷，核型評(píng)估工作由2名有資質(zhì)的高級(jí)實(shí)驗(yàn)室人員獨(dú)立完成。

1.9拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)檢測(cè) 按照QIAamp DNA Blood Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA。采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(A260/280 nm)值，計(jì)算DNA濃度及純度，取A260/280 nm比值為1.8～2.0的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。將50 ng DNA切割成300 bp大小的片段，通過(guò)末端標(biāo)記法、接頭連接和PCR擴(kuò)增的方式建立DNA文庫(kù)。使用BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，生成35 M有效數(shù)據(jù)量。

應(yīng)用Burrows-Wheeler算法，以hg19基因組序列為參照，唯一比對(duì)到基因組的序列數(shù)據(jù)量為2.8～3.2 M。根據(jù)Decipher、DGV、千人基因組以及OMIM等公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CNV進(jìn)行查詢，然后根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)2015年指南[8]對(duì)其致病性進(jìn)行評(píng)估解讀。變異被劃分為致病、可能致病、致病性未知(VUS)、可能良性或良性。

1.10飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè) 使用Agena MassARRAY飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)母體白細(xì)胞及備份血漿文庫(kù)進(jìn)行34個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)(rs9951171、rs987640、rs985492、rs891700、rs7520386、rs740598、rs722290、rs6444724、rs590162、rs560681、rs521861、rs4789798、rs3780962、rs321198、rs2833736、rs2831700、rs2830795、rs2811231、rs279844、rs2567608、rs2291395、rs214955、rs1872575、rs1736442、rs1554472、rs1523537、rs1498553、rs1478829、rs13218440、rs13182883、rs1109037、rs10768550、rs1031825、rs1004357)的比對(duì)，以排除混樣可能。如果樣本之間有≤3個(gè)位點(diǎn)不符合，則判斷來(lái)源于同一個(gè)樣本的可能性大；如果樣本之間有>3個(gè)位點(diǎn)不符合，則判斷混樣可能性大。

2 結(jié)果

2.13例孕婦、新生兒檢測(cè)結(jié)果與干預(yù)措施 孕婦1：34歲，孕3產(chǎn)1，孕12+1周超聲篩查提示胎兒頸后透明帶厚度2.6 mm；孕13周血清學(xué)篩查結(jié)果提示21三體綜合征臨界風(fēng)險(xiǎn)，風(fēng)險(xiǎn)值1/766；孕14+6周NIPS檢測(cè)結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)，胎兒濃度4.016%，體質(zhì)指數(shù)(BMI)=24.74；隨訪至孕19+1周，超聲提示胎兒雙側(cè)脈絡(luò)叢囊腫(左側(cè)1.3 cm×0.7 cm；右側(cè)1.2 cm×0.8 cm)，單臍動(dòng)脈；孕22+1周，胎兒雙頂徑5.6 cm，心臟聲像改變，右室雙出口(SDS)主動(dòng)脈瓣下室缺，完全型房室間隔缺損，后顱窩池增寬，雙手疑似重疊指。經(jīng)臍靜脈穿刺核型分析檢測(cè)結(jié)果為47,XN,+18(圖1A)，后終止妊娠。

孕婦2：38歲，孕2產(chǎn)1，未進(jìn)行孕早期胎兒頸項(xiàng)透明層(NT)檢測(cè)，未行血清學(xué)篩查檢測(cè)；孕16+1周、孕21+2周超聲檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)胎兒明顯異常；孕22+5周NIPS檢測(cè)結(jié)果提示低風(fēng)險(xiǎn)，胎兒濃度6.129%，BMI=24.60。于孕38+6周足月剖宮產(chǎn)1女，Apgar評(píng)分9分，精神反應(yīng)較好，面容表現(xiàn)為眼距寬、低耳位、頸蹼，左右手通貫掌，小指雙指節(jié)。超聲結(jié)果提示動(dòng)脈導(dǎo)管未閉，房間隔多發(fā)小缺損，卵圓孔未閉，三尖瓣中量反流，二尖瓣少量反流，肺動(dòng)脈高壓。經(jīng)外周血染色體核型分析檢測(cè)后結(jié)果為47，XN，+21(圖1B)。

孕婦3：29歲，孕2產(chǎn)1，血清學(xué)篩查結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)，孕期超聲提示單臍動(dòng)脈，孕21周NIPS檢測(cè)結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)，胎兒濃度21.686%，BMI=20.70。新生兒出生后外周血染色體核型分析檢測(cè)結(jié)果為47，XN，+21(圖1C)。

2.2實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制排查結(jié)果 3例NIPS假陰性樣本經(jīng)核對(duì)，樣本檢測(cè)過(guò)程未見(jiàn)異常。經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)比對(duì)的母親白細(xì)胞與文庫(kù)DNA的34個(gè)SNP位點(diǎn)，判斷為3例樣本文庫(kù)和白細(xì)胞來(lái)源一致，未發(fā)生標(biāo)本混樣。

2.3NIPS復(fù)測(cè)結(jié)果

2.3.1Complete Genomics與Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)NIPS檢測(cè)結(jié)果 3例樣本經(jīng)取備份血漿樣本分別使用Complete Genomics NIPS復(fù)測(cè)、半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)NIPS檢測(cè)后，檢測(cè)結(jié)果與Complete Genomics首次檢測(cè)結(jié)果一致，均為低風(fēng)險(xiǎn)(表1)。相應(yīng)CNVs圖示未見(jiàn)異常。

表1 Complete Genomics與Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)NIPS檢測(cè)結(jié)果

2.3.2Complete Genomics測(cè)序平臺(tái)NIPS與NIPS-Plus檢測(cè)結(jié)果 3例血漿樣本分別進(jìn)行NIPT-Plus檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與NIPS首次檢測(cè)及復(fù)測(cè)結(jié)果一致，均為低風(fēng)險(xiǎn)(表2)。Complete Genomics測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行的3次測(cè)序均未發(fā)現(xiàn)CNVs。

表2 Complete Genomics測(cè)序平臺(tái)NIPS與NIPS-Plus檢測(cè)結(jié)果

2.4母體白細(xì)胞及胎盤(pán)樣本CNVs檢測(cè)結(jié)果 3例樣本使用孕婦孕期備份白細(xì)胞樣本進(jìn)行CNVs檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)有1 M以上的缺失/重復(fù)。獲取樣本2胎盤(pán)膠囊制品(4粒)，經(jīng)CNVs檢測(cè)提示胎盤(pán)樣本存在chr21三體嵌合，異常比例分別為25%、25%、25%、24%。見(jiàn)圖2。未能取得樣本1和樣本3的胎盤(pán)樣本。

3 討論

近年來(lái)，NIPS與侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不符的情況時(shí)有報(bào)道，目前認(rèn)為與生物學(xué)有關(guān)的假陽(yáng)性因素主要包括CNVs、母體嵌合(maternal mosaicism)、限制性胎盤(pán)嵌合體(confined placental mosaicism，CPM)、雙胎消失綜合征(the vanishing twin syndrome)和孕婦患有惡性腫瘤[9]。相反，DNA濃度過(guò)低、嵌合體、胎兒細(xì)胞和染色體異常而胎盤(pán)染色體正常、母體CNVs、檢測(cè)Z值的統(tǒng)計(jì)學(xué)波動(dòng)是可能造成假陰性的主要原因[10]。但是對(duì)于增加測(cè)序深度及更換不同測(cè)序平臺(tái)是否會(huì)對(duì)檢測(cè)效果出現(xiàn)影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中3例NIPS假陰性樣本首先經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)樣本文庫(kù)和白細(xì)胞來(lái)源一致，未發(fā)生標(biāo)本混樣。

本研究中3例NIPS假陰性病例通過(guò)使用Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái)復(fù)測(cè)，結(jié)果仍為低風(fēng)險(xiǎn)，表明使用不同測(cè)序平臺(tái)對(duì)于避免假陰性結(jié)果作用有限。近幾年發(fā)展起來(lái)的NIPS-Plus技術(shù)將有效數(shù)據(jù)量提升至≥25 M，進(jìn)一步優(yōu)化算法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)更多染色體微缺失微重復(fù)的檢測(cè)。本研究對(duì)3例假陰性樣本使用NIPS-Plus技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示增加測(cè)序深度后未能避免假陰性的發(fā)生。孕婦血漿中胎兒DNA含量是影響NIPS準(zhǔn)確性的重要參數(shù)，胎兒DNA含量較低的樣本中可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果[6]。對(duì)樣本1、樣本2檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)胎兒DNA含量均偏低(小于10%)。對(duì)樣本2采集到的胎盤(pán)膠囊制品檢測(cè)，提示存在24%～25%的21三體嵌合，且其胎兒濃度為6.129%，導(dǎo)致用于21三體檢測(cè)的有效胎兒分?jǐn)?shù)減少(<2.2%)，低于NIPS方法的檢測(cè)閾值(3.5%)[11]。目前對(duì)于使用不同檢測(cè)平臺(tái)對(duì)比的研究較少，在本研究中不同檢測(cè)平臺(tái)(Complete Genomics測(cè)序平臺(tái)/Ion Torrent半導(dǎo)體測(cè)序平臺(tái))使用相應(yīng)DNA濃度算法未能避免該假陰性的發(fā)生。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NIPS可檢出異常細(xì)胞的嵌合率為29%以上的18和21三體嵌合樣本，但10%以下嵌合或低胎兒游離DNA濃度會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果[12]。綜合上述因素，考慮胎兒濃度與嵌合率均偏低是導(dǎo)致樣本2假陰性的原因。

本研究的局限性在于樣本量偏少，且未能取得樣本1和樣本3的胎盤(pán)樣本，無(wú)法排除限制性胎盤(pán)嵌合的可能性。考慮到樣本1的cffDNA濃度較低，推測(cè)可能是造成NIPS檢測(cè)假陰性的一個(gè)重要因素。但樣本3在cffDNA濃度比例較高的情況下，依舊出現(xiàn)檢測(cè)假陰性，可能存在更多的未知原因。這提示在臨床中對(duì)NIPS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行咨詢的時(shí)候，需要適當(dāng)考慮cffDNA濃度因素。對(duì)于NIPS低風(fēng)險(xiǎn)病例，應(yīng)超聲定期隨訪，如發(fā)現(xiàn)超聲持續(xù)異常，建議進(jìn)一步遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，在一定程度上能避免有明顯畸形的NIPS假陰性胎兒的出生。同時(shí)有效保存孕婦生產(chǎn)后胎盤(pán)樣本將有助于更好地分析判斷假陰性出現(xiàn)的原因。