徐 程，李 霄，馬淑穎，張 響，張智弘

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)是來源于葡萄膜黑色素細(xì)胞的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，約占所有黑色素瘤的5%，該腫瘤預(yù)后不良，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，則迅速引起患者死亡[1]。不同于歐美人群，UM在東亞人群中發(fā)病率較低，這也導(dǎo)致其在國內(nèi)的臨床病理研究進展緩慢。近年隨著分子靶向和免疫治療的發(fā)展，我國已制定了相應(yīng)的黑色素瘤臨床診療指南及規(guī)范化的病理診斷專家共識，但這些指南和共識主要針對皮膚及黏膜黑色素瘤[2]。目前，國內(nèi)關(guān)于UM的系統(tǒng)性報道較少，本文分析22例UM的臨床病理學(xué)特征，旨在為其精準(zhǔn)治療提供病理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年1月～2019年6月江蘇省人民醫(yī)院病理學(xué)部診斷明確的原發(fā)性UM 22例(剔除眶周皮膚黑色素瘤、結(jié)膜黑色素瘤)，所有病例均具有完整的臨床病理資料，包括患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤最大直徑、腫瘤厚度，調(diào)取并復(fù)習(xí)所有HE切片、免疫組化切片。通過電話或門診病歷系統(tǒng)對患者進行隨訪。

1.2 病理分型目前UM仍沿用1980年改良Callender分型系統(tǒng)[3]：(1)梭形細(xì)胞A型，腫瘤細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核染色質(zhì)細(xì)膩，無顯著核仁；(2)梭形細(xì)胞B型，腫瘤細(xì)胞呈梭形、有黏附感，常似合胞體，細(xì)胞核染色質(zhì)粗糙呈雪茄樣，核仁顯著；(3)上皮樣型，腫瘤細(xì)胞呈上皮樣，黏附力差，胞質(zhì)豐富、嗜伊紅，核仁大而圓；(4)混合型，大多是梭形細(xì)胞B型與上皮樣型混合。梭形細(xì)胞型及上皮樣細(xì)胞型的診斷均需該成分腫瘤細(xì)胞比例大于90%，否則診斷為混合型。

1.3 常用術(shù)語及標(biāo)準(zhǔn)(1)核分裂象：選取熱點區(qū)或代表性區(qū)域，按每平方毫米計數(shù)核分裂象個數(shù)(本實驗顯微鏡目鏡直徑22 mm，每高倍視野面積0.237 mm2，1 mm2相當(dāng)于4.2個高倍視野)[2]。(2)淋巴細(xì)胞浸潤程度：黑色素瘤的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞是指在腫瘤細(xì)胞之間浸潤、破壞腫瘤細(xì)胞巢的淋巴細(xì)胞，不包括圍繞于腫瘤細(xì)胞周邊的淋巴細(xì)胞；并用浸潤淋巴細(xì)胞的密度和范圍來表示程度：無腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞；有但不活躍(局灶區(qū)域有腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞)；活躍(整個腫瘤彌漫淋巴細(xì)胞浸潤)[2]。

1.4 方法

1.4.1褪黑色素 切片4 μm厚，放入0.5%高錳酸鉀水溶液中1～2 h，蒸餾水洗5～10 s，2%草酸水溶液3～5 min，自來水洗5 min，顯微鏡下觀察黑色素是否褪黑(如果沒有褪黑，蒸餾水洗后重復(fù)第一步)。

1.4.2免疫組化 切片4 μm厚，免疫組化染色應(yīng)用EnVision兩步法，所用一抗HMB-45、Melan-A、S-100、Ki-67、CKpan等均購自福州邁新公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4.3基因檢測 按照試劑盒說明書提取基因組DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, QIAGEN公司)，顯微鏡下觀察HE切片，選擇腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域(腫瘤成分>80%)刮入EP管，加裂解液。BRAF V600E突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物公司，采用熒光PCR法擴增，按說明書步驟檢測BRAF V600E體細(xì)胞突變。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征22例UM中男性10例，女性12例；年齡25～79歲(中位年齡58.5歲)；位于左眼10例，右眼12例；21例位于脈絡(luò)膜，1例位于睫狀體；腫瘤最大徑5～20 mm，中位值10.5 mm，腫瘤厚度3～15 mm，中位值8 mm。16例表現(xiàn)為視力下降、視物模糊，4例為眼前黑影，1例為眼前閃光感，1例為眼紅、眼部脹痛。患者術(shù)前均行影像學(xué)評估，MRI主要表現(xiàn)為：平掃T1WI呈類圓形稍高或高信號，T2WI呈低信號，瘤體血供豐富，增強后呈強化不均；部分腫瘤內(nèi)可合并出血，MRI上信號不均勻(圖1)。術(shù)后2例患者行鉑類化療，其余病例未輔以其他治療。

圖1 MRI左眼球后壁內(nèi)側(cè)緣見類圓形異常信號，T1WI(藍(lán)色箭頭)呈稍高信號，T2WI(紅色箭頭)壓脂序列呈低信號

2.2 病理組織學(xué)特征及分型腫瘤肉眼呈扁橢圓形或“圓頂狀”，境界尚清(圖2)。鏡下形態(tài)豐富，細(xì)胞呈梭形或上皮樣，多形性、異型性顯著，核染色質(zhì)粗糙，具有大小不等的核仁(圖3)，排列方式多樣，可圍繞血管呈假菊形團樣(圖4)，或呈條束狀、魚骨樣排列，或呈巢、團狀排列，多數(shù)病例腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生豐富的黑色素，有時甚至遮蓋整張切片，必須通過褪黑色素方可觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。免疫表型：腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)HMB-45、Melan-A(圖5)、S-100。22例UM中，梭形細(xì)胞A型0例；梭形細(xì)胞B型9例：腫瘤細(xì)胞呈較一致的梭形，細(xì)胞間黏附力強，核染色質(zhì)粗糙，呈雪茄樣，有核仁(圖6)；上皮樣型5例：腫瘤細(xì)胞大而不規(guī)則，呈顯著上皮樣，異型性更加顯著，細(xì)胞間黏附力差，胞質(zhì)豐富、嗜伊紅，紅核仁大而顯著(圖7)；混合型8例：梭形細(xì)胞型和上皮樣型兩種形態(tài)均>10%，其中有3例出現(xiàn)了“氣球樣細(xì)胞”(圖8)，即胞質(zhì)呈泡沫樣，富含脂質(zhì)。

②③④⑤⑥⑦⑧⑨

2.3 核分裂象及淋巴細(xì)胞浸潤程度計數(shù)每平方毫米(本顯微鏡下約4.2個高倍視野)的核分裂象(圖9)，核分裂象總體個數(shù)為1～5個/mm2，中位值2個/mm2。腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞整體不活躍，僅2例有少許腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，其余病例均無腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞。

2.4 BRAF基因檢測22例UM均行BRAF V600E突變檢測，結(jié)果均為野生型(圖10)。

圖10 熒光PCR檢測BRAF V600E均為野生型

2.5 隨訪22例中2例失訪，20例獲得隨訪資料，隨訪時間8～73個月(平均33.5個月)，1例術(shù)后26個月死亡，1例術(shù)后12個月發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移(該例轉(zhuǎn)移后隨訪4個月患者尚存活)，其余18例均無瘤生存。

3 討論

葡萄膜也稱眼色素膜，是眼球壁的第二層，分為前部的虹膜、中部的睫狀體和后部的脈絡(luò)膜。UM是成人最常見的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，具有明顯的地區(qū)、種族差異，好發(fā)于高加索人群，亞非地區(qū)發(fā)病率較低，每年新發(fā)病例僅2～3/1 000萬；好發(fā)于中老年人，中國人群發(fā)病中位年齡45歲；無明顯性別差異[1]。腫瘤好發(fā)于單側(cè)眼球，雙側(cè)受累罕見，大多位于脈絡(luò)膜(90%)，少數(shù)位于睫狀體(6%)和虹膜(4%)[1]，本組僅1例位于睫狀體，其余均位于脈絡(luò)膜，與文獻(xiàn)報道相似。腫瘤早期臨床無明顯癥狀，部分可出現(xiàn)閃光感、飛蚊癥，或視力障礙，晚期腫瘤較大壓迫可引起眼球疼痛、充血、青光眼等[4]，本組病例臨床表現(xiàn)以視力下降、視物模糊為主，少數(shù)表現(xiàn)為黑影、閃光感或眼部脹痛。

黑色素腫瘤組織形態(tài)學(xué)譜系十分寬泛，腫瘤排列方式多樣，可圍繞血管呈假菊形團樣，可似肉瘤；呈條束狀、魚骨樣排列，也可似癌；呈巢團狀排列，腫瘤間質(zhì)血竇較豐富；細(xì)胞多形性、異型性顯著，形態(tài)可呈長梭形、短梭形、上皮樣，唯一具有診斷價值并恒定出現(xiàn)的細(xì)胞學(xué)特征是清晰的紅核仁[5]；免疫組化標(biāo)記HMB-45、Melan-A、S-100對UM的診斷有重要價值，也大大減低了其診斷難度，但認(rèn)識和區(qū)分UM病理亞型對其預(yù)后具有重要價值。不同研究中各型黑色素瘤所占比例差異較大，這可能是由于地區(qū)和樣本量差異造成的[6-7]。上皮樣亞型侵襲性強、轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，患者5年生存率遠(yuǎn)低于梭形細(xì)胞亞型[1]，但上皮樣細(xì)胞在腫瘤中所占的比例與患者預(yù)后的關(guān)系并不明確，有研究認(rèn)為，無論比例，只要出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞即提示腫瘤惡性程度更高，從而建議將其病理細(xì)胞學(xué)分型簡化，只需報告腫瘤中是否存在上皮樣細(xì)胞即可[8]，本實驗也支持此觀點，本組中1例患者術(shù)后26個月死亡，1例患者術(shù)后12個月發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，這2例中均存在上皮樣細(xì)胞。改良Callender分型系統(tǒng)將梭形細(xì)胞型分為A型和B型，本組中均為B型，而國內(nèi)其他對UM進行Callender分型的研究中，未將梭形細(xì)胞型黑色素瘤詳細(xì)分為梭形細(xì)胞A型及梭形細(xì)胞B型。事實上，梭形細(xì)胞A型的診斷需十分謹(jǐn)慎，A型細(xì)胞十分溫和，核染色質(zhì)細(xì)膩，無顯著核仁，形態(tài)上類似神經(jīng)纖維瘤或平滑肌瘤，更有人提出既往診斷的梭形細(xì)胞A型黑色素瘤實際上是梭形細(xì)胞色素痣[9]，但梭形細(xì)胞色素痣診斷標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格，細(xì)胞缺乏多形性和異型性，梭形細(xì)胞A型黑色素瘤的細(xì)胞有多少不等的多形性和異型性。本組中還發(fā)現(xiàn)有3例出現(xiàn)“氣球樣細(xì)胞”，文獻(xiàn)報道多出現(xiàn)于脈絡(luò)膜黑色素瘤，意義尚不明確，有研究認(rèn)為這是由于色素的退變造成的，一般出現(xiàn)于腫瘤放、化療后[10]，本組有3例均位于脈絡(luò)膜，但術(shù)前均未行其他治療，出現(xiàn)此類細(xì)胞原因不明。

與皮膚黏膜黑色素瘤一樣，UM中出現(xiàn)高核分裂象也提示腫瘤的不良轉(zhuǎn)歸，《英國葡萄膜黑色素瘤國家指南》中推薦的核分裂象計數(shù)方法是計數(shù)40個高倍視野下的核分裂象[11]，但不同顯微鏡的高倍視野直徑有差異，故本實驗采用《中國黑色素瘤規(guī)范化病理診斷專家共識(2017版)》的標(biāo)準(zhǔn)，計數(shù)1 mm2的核分裂象[2]，與全身其他部位黑色素瘤標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一。與皮膚黑色素瘤相比，UM的產(chǎn)色素能力更加顯著，有時黑色素覆蓋整張切片，實際工作中往往由于色素遮蓋或褪黑色素不成功導(dǎo)致核分裂象難以觀察，故一張高質(zhì)量的褪黑色素片在UM的診斷中十分關(guān)鍵。

依據(jù)臨床特征、HE形態(tài)、免疫組化標(biāo)記，UM的診斷一般較明確，需與其鑒別的腫瘤如下。(1)其他部位的黑色素瘤轉(zhuǎn)移至眼部，或眼部皮膚、結(jié)膜黑色素瘤累及葡萄膜：這往往提示腫瘤進入晚期，預(yù)后較差，其與葡萄膜原發(fā)黑色素瘤的起源不同、腫瘤分期也不同。(2)葡萄膜良性色素痣：其發(fā)病率較UM更低，診斷標(biāo)準(zhǔn)也更嚴(yán)格，腫瘤直徑多<5 mm、厚度<2 mm[12]，細(xì)胞形態(tài)溫和、缺乏多形性和異型性，核分裂象罕見[13]，形態(tài)上與梭形細(xì)胞A型UM難以鑒別。(3)葡萄膜神經(jīng)鞘瘤：形態(tài)與軟組織神經(jīng)鞘瘤相似，梭形細(xì)胞交替排列為束狀區(qū)(Antoni A區(qū))和網(wǎng)狀區(qū)(Antoni B區(qū))，常見柵欄狀結(jié)構(gòu)及Verocay小體，免疫組化表達(dá)神經(jīng)起源的標(biāo)記S-100和SOX10，尤其要注意其與梭形細(xì)胞型UM的鑒別。

UM的預(yù)后與病理亞型相關(guān)，梭形細(xì)胞亞型的5年生存率約88%，上皮樣亞型和混合型5年生存率約60%，腫瘤一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則患者多在1年內(nèi)死亡，最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位是肝臟(約90%)[14]，郭琳潔等[6]報道患者生存時間與腫瘤最大徑、最大高度及腫瘤的浸潤深度呈負(fù)相關(guān)。本組1例患者術(shù)后26個月死亡，1例患者術(shù)后12個月發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移，與文獻(xiàn)報道相似。由于病例數(shù)和隨訪時間的限制，本實驗未對其進行生存分析，故未來還需針對中國人群進行多中心大樣本的臨床病理及預(yù)后分析。提示UM預(yù)后不良的臨床參數(shù)：腫瘤體積較大(腫瘤最大徑與腫瘤厚度)、累及睫狀體、有眼外累及等；病理參數(shù)：出現(xiàn)上皮樣細(xì)胞、較高的核分裂象等，故一份規(guī)范化的UM病理報告需包含上述指標(biāo)[11]。

BRAF是黑色素瘤最常見的基因變異，也是與治療最相關(guān)的靶點，其中約90%為V600E突變(谷氨酸取代纈氨酸)，我國黑色素瘤的BRAF突變率約25.5%[2]。不同于皮膚和黏膜，BRAF V600E基因突變在歐美UM人群中的檢測率極低，但中國人群的突變情況尚無大樣本的檢測數(shù)據(jù)，本組檢測22例BRAF V600E體細(xì)胞突變均為野生型，與歐美人群的檢測結(jié)果一致[15]，提示近年來獲批的BRAF突變靶向治療藥物對UM治療效果有限，同時提示UM有其獨特的分子遺傳學(xué)特點。編碼G蛋白Gα亞基的GNAQ、GNA11是近幾年發(fā)現(xiàn)的UM中最常見的驅(qū)動基因，在歐美人群中的突變率可高達(dá)80%，且GNA11在轉(zhuǎn)移灶中的突變率比GNAQ更高；該突變還存在于葡萄膜的色素痣、藍(lán)痣、中樞神經(jīng)系統(tǒng)黑色素細(xì)胞瘤中，但該驅(qū)動基因在亞洲人群中的突變率較低，且目前尚無針對該基因的靶向治療藥物[15-16]。定位于染色體3p21.1的BAP-1，既往發(fā)現(xiàn)其與肺癌、乳腺癌、間皮瘤等多種惡性腫瘤相關(guān)，最近也被發(fā)現(xiàn)在84%的轉(zhuǎn)移性UM中失表達(dá)，BAP-1與內(nèi)皮屏障功能相關(guān)，其失表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞由眼部播散至體循環(huán)，最易播散于肝臟，故BAP-1蛋白與UM的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，也提示不良預(yù)后[17]。此外，部分UM中還檢測出一些異常染色體核型：如3號染色體單倍體型、8號染色體多倍體型[15-16]。免疫逃避相關(guān)機制在UM中的研究尚處于起步階段，有研究對UM采用抗PD-L1免疫治療，僅3.6%的病例能從中獲益[16]，效果遠(yuǎn)不如皮膚黑色素瘤敏感，這可能與其所處的腫瘤微環(huán)境相關(guān)，本組UM的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞極不活躍，也印證了這一點。

目前國內(nèi)對于UM尚無規(guī)范化的診療指南，診斷上依賴影像學(xué)早期發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)的病理學(xué)評估，手術(shù)摘除眼球仍是一線治療方案，部分術(shù)后輔以放療、光療或廣譜化療，但療效并不確切[11]。

綜上所述，UM有其獨特的臨床、病理、分子遺傳學(xué)特征，不應(yīng)簡單將其歸為全身黑色素瘤的一部分，皮膚、黏膜黑色素瘤的診療指南也不完全適用于UM；一份規(guī)范化的UM病理診斷報告需要包括腫瘤大小、病理亞型、核分裂象、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、免疫組化結(jié)果等一系列參數(shù)；治療上除手術(shù)摘除眼球外，針對GNAQ、GNA11的分子靶向治療將成為晚期轉(zhuǎn)移性UM的研究熱點。