童天嬌， 劉軍海， 劉 艷， 曹 瑞， 魏玲玲

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

楊梅樹(shù)又名山楊梅、朱紅、珠蓉，屬于楊梅科常綠喬木，適應(yīng)性廣，易于栽培，適宜在酸性的土壤種植。楊梅樹(shù)的人工栽培技術(shù)已經(jīng)有2 000多年的歷史，中國(guó)的浙江、江蘇、臺(tái)灣、福建等地均有分布，在東南亞國(guó)家也有分布。楊梅樹(shù)生長(zhǎng)于山坡或山谷森林中，樹(shù)齡長(zhǎng)，可綠化美化環(huán)境，具有很高的觀賞價(jià)值。楊梅果實(shí)、楊梅葉、楊梅根、楊梅樹(shù)皮等均有食用或藥用價(jià)值。楊梅葉含有黃酮類(lèi)化學(xué)物、原花青素、精油等多種活性成分，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。楊梅葉中黃酮類(lèi)化合物的主要成分為楊梅素，又名楊梅樹(shù)皮素、楊梅黃酮，是一種多羥基黃酮，具有抗氧化作用，置于空氣中易被氧化成綠色[1]。楊梅素主要來(lái)源是楊梅科及其他天然植物，因具有多樣的醫(yī)藥價(jià)值而受到廣泛的關(guān)注和大量的研究[2-4]。從楊梅樹(shù)自身的應(yīng)用價(jià)值來(lái)看，楊梅頸條、楊梅枝條和楊梅葉均含有楊梅素[5-6]。楊梅葉資源豐富，目前沒(méi)有得到有效的利用，大量廢棄造成資源的浪費(fèi)。因此，本研究以楊梅葉為原料，采用超聲波提取工藝提取楊梅素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，并考察了楊梅素的抗氧化活性，以期為楊梅素的提取與應(yīng)用，以及楊梅葉資源的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

楊梅葉，采于浙江余姚市；楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥97%)，上海笛柏生物科技有限公司；維生素C片，西安利君制藥有限責(zé)任公司；DPPH、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、水楊酸、無(wú)水乙醇，均為分析純。

FW117中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；722可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司制造；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Cary50型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安；LC-2030液相色譜儀，島津公司。

1.2 楊梅素的提取與測(cè)定方法

1.2.1原料的預(yù)處理 楊梅葉經(jīng)蒸餾水清洗、自然晾干后，于60 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定，然后粉碎機(jī)粉碎過(guò)425 μm篩，得到楊梅葉粉末，備用。

1.2.2楊梅素的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的楊梅葉粉末于燒杯中，加入一定量的乙醇溶液浸泡0.5 h后，加表面活性劑茶皂素[7]，在超聲波[8]提取器中設(shè)置一定溫度、時(shí)間進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，冷卻至室溫，離心，收集離心瓶中的溶液于量筒中，記錄其體積(V)，得到楊梅素的提取液，稀釋一定的倍數(shù)，采用液相色譜儀在檢測(cè)波長(zhǎng)373 nm時(shí)測(cè)定楊梅素的色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算楊梅素質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算楊梅素的提取得率。

式中：Y—楊梅素提取得率，%;C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的楊梅素質(zhì)量濃度，g/L；V—楊梅素提取液的體積，L；N—提取液的稀釋倍數(shù)；m—稱(chēng)取楊梅葉粉末質(zhì)量，g。

1.2.3保留時(shí)間的確定 準(zhǔn)確稱(chēng)取楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液溶解于100 mL容量瓶。在離心管中取少量楊梅素稀釋液，離心機(jī)轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后，取一定體積定容至50 mL，用液相色譜儀測(cè)定[9]，檢測(cè)器為UV-Vis,檢測(cè)波長(zhǎng)為373 nm[10]，C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，粒徑3.5 μm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min。楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖1(a)，楊梅素提取液色譜圖見(jiàn)圖1(b)。由圖可知，楊梅素的保留時(shí)間為2.3 min左右。

圖1 楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品(a)和提取液(b)的色譜圖

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品，并用80%乙醇溶液溶解于100 mL容量瓶。于6個(gè)25 mL容量瓶分別移取2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0和12.0 mL上述溶液，用80%乙醇溶液稀釋定容搖勻靜置；分別取少量的稀釋液，以1.2.3節(jié)方法進(jìn)行離心操作，在373 nm處分別測(cè)定各溶液的色譜峰面積；以楊梅素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在質(zhì)量濃度0.016～0.096 g/L范圍內(nèi)，得到線性回歸方程為：y=455 795.21x-86 988.6，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，說(shuō)明峰面積與溶液質(zhì)量濃度之間有良好的線性關(guān)系。

1.3 楊梅素的抗氧化性實(shí)驗(yàn)

1.3.1DPPH自由基清除率的測(cè)定 按文獻(xiàn)[11-12]方法，以正交試驗(yàn)所得到的最佳提取工藝提取楊梅素，將楊梅素溶液稀釋配制成0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5和3.0 mg/L系列溶液。以無(wú)水乙醇為溶劑，在棕色容量瓶中制備濃度為0.1 mol/L DPPH自由基溶液。將不同質(zhì)量濃度的楊梅素溶液各取2.0 mL于 10 mL 試管，并加入2.0 mL DPPH自由基溶液，搖勻，反應(yīng)30 min，在377 nm測(cè)量吸光度(Ai)。另取不同質(zhì)量濃度的楊梅素溶液2.0 mL于10 mL試管中，用2.0 mL無(wú)水乙醇代替DPPH自由基溶液，反應(yīng)30 min，測(cè)量吸光度(Aj)。用2.0 mL DPPH自由基溶液和2.0 mL無(wú)水乙醇溶液代替楊梅素溶液，搖勻，反應(yīng)30 min，測(cè)量吸光度(A0)作為參比，用相同的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定VC的抗氧化活性。楊梅素對(duì)DPPH·清除率(η)的計(jì)算公式為：η=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

1.3.2OH自由基清除率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13-14]方法，將楊梅素稀釋成30、 60、 90、 120和150 mg/L 的溶液。取1 mL不同質(zhì)量濃度的楊梅素稀釋液于試管中，各加入1 mL的2.25 mmol/L FeSO4和2.25 mmol/L H2O2至混合液中，靜置10 min后，加入1 mL 2.25 mmol/L水楊酸溶液，混合溶液置于黑暗處反應(yīng)30 min，于377 nm處測(cè)定溶液的吸光度(Ai)；使用蒸餾水代替水楊酸溶液，測(cè)其吸光度(Aj)；用蒸餾水代替楊梅素溶液，測(cè)其吸光度(A0)，通過(guò)相同的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定VC的抗氧化活性。楊梅素對(duì)·OH 清除率(η)的計(jì)算公式同1.3.1節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 楊梅素提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1液料比 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g楊梅葉粉末5份，置于5個(gè)100 mL燒杯中，以液料比10 ∶1、 15 ∶1、 20 ∶1、 25 ∶1和30 ∶1(mL ∶g，下同)分別加入80%的乙醇溶液，搖勻，浸泡0.5 h之后，加入0.5%(以楊梅葉粉末質(zhì)量計(jì)，下同)表面活性劑茶皂素，設(shè)定超聲波提取溫度60 ℃，提取時(shí)間40 min，進(jìn)行超聲波提取。液料比值對(duì)提取得率的影響見(jiàn)圖2(a)。由圖2(a)可以看出，隨著液料比值的增加，楊梅素的提取得率呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，液料比值為20時(shí)，提取得率最大為1.211%。這是因?yàn)殡S著提取溶劑用量的增加，楊梅素可以充分地溶解，提取得率增加；當(dāng)液料比值達(dá)到20時(shí)，楊梅素已基本溶解，此后再增加提取溶劑用量，對(duì)提取得率幾乎沒(méi)有影響。因此，適宜的液料比為20 ∶1。

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g楊梅葉粉末5份，置于5個(gè)100 mL燒杯中，分別加入60%、 70%、 80%、 90%和100%的乙醇溶液20 mL，搖勻，浸泡0.5 h后，分別加入0.5%表面活性劑，按照2.1.1節(jié)方法進(jìn)行超聲波提取，計(jì)算楊梅素的提取得率。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)楊梅素提取得率的影響見(jiàn)圖2(b)。由圖2(b)可以看出，楊梅素的提取得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加不斷增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，提取得率達(dá)到1.143%，此后體積分?jǐn)?shù)再增加，楊梅素提取得率開(kāi)始不斷下降。根據(jù)相似相溶原理，原因是楊梅素與80%的乙醇水溶液的極性接近。因此合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

2.1.3提取溫度 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g楊梅葉粉末5份，置于5個(gè)100 mL燒杯中，加入體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液20 mL，浸泡后加入0.5%表面活性劑，分別控制提取溫度為40、 50、 60、 70和80 ℃，按照2.1.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行超聲波提取，并計(jì)算楊梅素的提取得率。提取溫度對(duì)得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2(c)。由圖2(c)可以看出，當(dāng)溫度不斷升高時(shí)，楊梅素的提取得率呈先增加后降低的趨勢(shì)，在溫度60 ℃時(shí)，提取得率最大為1.165%。這是因?yàn)闇囟壬?，楊梅素的溶解度增加，故可以提高其提取得率。楊梅素為大分子有機(jī)化合物，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，結(jié)構(gòu)被一定程度地破壞，失去活性；同時(shí)高溫也會(huì)影響表面活性劑的增溶效果，故提取得率會(huì)降低。綜合分析適宜的提取溫度為60 ℃。

2.1.4提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g楊梅葉粉末5份，置于5個(gè)100 mL燒杯中，按液料比20 ∶1加入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液，浸泡后加入0.5%表面活性劑，分別控制超聲波提取時(shí)間為20、 30、 40、 50和60 min，按照2.1.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行超聲波提取，并計(jì)算楊梅素的提取得率。提取時(shí)間對(duì)楊梅素提取得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2(d)。由圖2(d)可以看出，提取時(shí)間達(dá)到20～50 min時(shí)，楊梅素的提取得率從0.965% 增加到1.273%，提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)得率又有所下降。這是因?yàn)闂蠲匪厝芙庥谌軇┲行枰欢螘r(shí)間，故提取時(shí)間的增加為楊梅素提取提供很好的條件，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致楊梅素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響提取效果。故選擇50 min為適宜的提取時(shí)間。

2.1.5表面活性劑用量 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g楊梅葉粉末5份，置于5個(gè)100 mL燒杯中，按液料比20 ∶1加入體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液，浸泡0.5 h后，加入0.1%、 0.3%、 0.5%、 0.7%和0.9%表面活性劑茶皂素[15]，即0.001、 0.003、 0.005、 0.007和0.009 g，按照2.1.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行超聲波提取，并計(jì)算楊梅素的提取得率。表面活性劑用量對(duì)楊梅素提取得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2(e)。由圖2(e)可以看出，在表面活性劑用量為0.1%～0.9%的范圍內(nèi)，楊梅素的提取得率先增大后減小，用量為0.5%時(shí)提取得率最大為1.169%。茶皂素是一類(lèi)天然提取的表面活性劑，利用分子結(jié)構(gòu)的兩親性可改變提取溶液的界面性質(zhì)，以此影響楊梅素的提取結(jié)果，故表面活性劑對(duì)楊梅素有增溶效果[15-16]，提取得率提高。由圖可知在表面活性劑用量為0.5%時(shí)提取得率最大，故表面活性劑的適宜用量為0.5%。

a.液料比liquid-to-material ratio; b.乙醇體積分?jǐn)?shù)ethanol volume fraction; c.提取溫度extraction temperature;

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

2.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和表面活性劑用量這5個(gè)因素，選取4個(gè)不同水平，設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn)，以此進(jìn)一步優(yōu)化楊梅素的最佳提取工藝條件，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析見(jiàn)表1。由表1可以看出，楊梅葉中楊梅素的最佳提取工藝條件為A2B2C3D2E1，即液料比15 ∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間為50 min，表面活性劑用量0.3%(0.003 g)，提取得率最高可達(dá)到1.35%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析Table 1 Orthogonal experimental design and visual analysis

2.2.2正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析 對(duì)表1結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析表明，液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取得率的影響較大，提取溫度、提取時(shí)間和表面活性劑用量對(duì)提取得率的影響較小。因此，實(shí)際操作過(guò)程中，可適當(dāng)升高溫度，減少提取時(shí)間或增加表面活性劑用量，以提高生產(chǎn)能力，節(jié)約生產(chǎn)成本。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 2 Variance analysis of orthogonal experimental results

2.2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 對(duì)2.2.1節(jié)的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，操作條件分別為液料比15 ∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間為50 min，表面活性劑的用量0.3%。平行3次實(shí)驗(yàn)，提取得率取平均值，最終楊梅素提取得率為1.33%。

茶皂素是一類(lèi)天然表面活性劑，用于楊梅素的提取不會(huì)造成二次污染，符合現(xiàn)在的綠色環(huán)保理念。本研究采用茶皂素強(qiáng)化提取技術(shù)，對(duì)比鄧丹雯等[17]未加表面活性劑茶皂素提取楊梅素提取時(shí)間為1.5 h，提取得率為1.355%，在本實(shí)驗(yàn)中加入茶皂素之后提取得率為1.33%，提取時(shí)間為50 min,可見(jiàn)加入茶皂素能縮短提取時(shí)間，降低提取成本，具有較好的發(fā)展前景，可為楊梅素的提取以及楊梅葉的開(kāi)發(fā)提供很好的參考價(jià)值。

2.3 楊梅素抗氧化性分析

2.3.1DPPH·清除率 楊梅素對(duì)DPPH·的清除率結(jié)果見(jiàn)圖3(a)。由圖3(a)可以看出，在質(zhì)量濃度0.5～3.0 mg/L的范圍內(nèi)，VC和楊梅素對(duì)DPPH·的清除率均不斷增加，在低濃度時(shí)兩者的抗氧化能力均隨濃度的升高快速增加，但楊梅素的清除率始終低于VC；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到最高3.0 mg/L時(shí)，VC的清除率達(dá)到56.49%，此時(shí)楊梅素清除率最高為52.11%。其中，楊梅素對(duì)DPPH·的IC50值為2.670 mg/L，VC對(duì)DPPH·的IC50值為2.363 mg/L。在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)兩者的清除效果差別不大，但VC的DPPH·清除效果要略?xún)?yōu)于楊梅素。

2.3.2·OH清除率 楊梅素對(duì)·OH的清除率結(jié)果見(jiàn)圖3(b)。由圖3(b)可知，質(zhì)量濃度為30～150 mg/L 時(shí)，VC對(duì)·OH的清除率不斷增加，在150 mg/L時(shí)達(dá)到最高74.96%；而楊梅素對(duì)·OH的清除率先增加后保持穩(wěn)定，當(dāng)質(zhì)量濃度為120 mg/L時(shí)，楊梅素對(duì)·OH的清除率達(dá)到最高為64.21%，此時(shí)VC的清除率為72.11%。其中，楊梅素對(duì)·OH的IC50值為91.139 mg/L，VC對(duì)·OH的IC50值為61.483 mg/L?？梢钥闯觯瑮蠲匪氐摹H清除效果略低于VC。

圖3 DPPH· (a)和·OH(b)清除率的測(cè)定

3 結(jié) 論

3.1以楊梅葉為原料，表面活性劑茶皂素為提取強(qiáng)化劑，采用超聲波提取工藝，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化楊梅素的提取工藝。結(jié)果表明：楊梅素提取的最佳工藝條件為液料比15 ∶1(mL ∶g)，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間50 min，表面活性劑茶皂素用量為原料質(zhì)量的0.3%，在此工藝條件下，楊梅素提取得率可達(dá)到1.33%。

3.2楊梅素抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到3.0 mg/L時(shí)，VC對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到56.49%，楊梅素對(duì)DPPH·的清除率為52.11%，VC和楊梅素對(duì)DPPH·的IC50值分別為2.363和2.670 mg/L；當(dāng)質(zhì)量濃度為150 mg/L 時(shí)，VC對(duì)·OH的清除率達(dá)到最高74.96%，而楊梅素對(duì)·OH的清除率在120 mg/L時(shí)達(dá)到最大，為64.21%，VC和楊梅素對(duì)·OH的IC50值分別為61.483和91.139 mg/L?？梢钥闯?，楊梅素對(duì)DPPH·和·OH清除率較高，抗氧化能力較好，但整體效果略低于VC。