陳 吉 張文思

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性病變，在致癌因素的影響下，結(jié)腸黏膜上皮發(fā)生惡變。1974年Morson[1]深入研究了結(jié)腸癌的發(fā)展過程，提出了結(jié)腸黏膜癌變過程大多遵循“腺瘤-癌”順序，腺瘤為其中一個(gè)發(fā)展階段，發(fā)生癌變的結(jié)腸黏膜組織大部分由腺瘤發(fā)展而來[2-4]。此觀點(diǎn)已被普遍接受，并且目前認(rèn)為結(jié)腸癌是由多基因及多步驟參與形成的。研究結(jié)果表明，基因突變、缺失等引起的表達(dá)異常與腫瘤形成密切相關(guān)，在某些刺激因素的作用下，原癌基因可能會(huì)被激活，從而發(fā)生惡性腫瘤，這是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的主要影響因素。當(dāng)抑癌基因在某些因素作用下發(fā)生突變、功能下降或缺失等情況時(shí)，其腫瘤抑制作用會(huì)明顯減弱，使組織惡變的風(fēng)險(xiǎn)大大增加，腫瘤發(fā)生率顯著升高。

肝癌缺失基因-1(DLC-1)是1998年由Yuan等從人原發(fā)性肝癌細(xì)胞中克隆得到的一個(gè)候選抑癌基因。DLC-1蛋白具有3個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域，即RhoGTP酶激活蛋白(RhoGAP)、類固醇急性調(diào)節(jié)相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移域(START)和山姆(SAM)結(jié)構(gòu)域，在SAM和RhoGAP結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)黏著斑定位序列，這是一段富含絲氨酸的區(qū)域[5]，DLC-1蛋白可通過此序列與含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白(如張力蛋白、肌動(dòng)蛋白)結(jié)合并參與形成黏著斑，在黏著斑定位和腫瘤抑制過程中發(fā)揮重要的作用。黏著斑激酶(FAK)是一種非受體型酪氨酸激酶，位于多條信號通路的關(guān)鍵點(diǎn)，其在細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附過程中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)AK激活后通過一定的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與細(xì)胞的分化、增生以及腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程[6-7]。本研究聯(lián)合檢測了結(jié)腸腺瘤癌變過程中不同階段的DLC-1和FAK表達(dá)水平，探討兩者在此過程中的相互關(guān)系及臨床意義，以期為結(jié)腸惡性腫瘤的早期診斷提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2017年12月至2018年10月就診于內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院消化內(nèi)科的患者(體檢或有慢性腹痛、腹脹、排便異常等消化道癥狀)，收集對其進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查或治療時(shí)獲取的結(jié)腸組織標(biāo)本，根據(jù)結(jié)腸鏡下形態(tài)學(xué)觀察及病理診斷分為正常黏膜組、結(jié)腸腺瘤組及結(jié)腸癌組。正常黏膜組30例，男性17例，女性13例，年齡24～77歲，平均年齡(52.67±14.30)歲；腺瘤組30例，男性11例，女性19例，年齡26～79歲，平均年齡(54.63±15.76)歲；結(jié)腸癌組30例，男性18例，女性12例，年齡38～79歲，平均年齡(59.30±10.98)歲。所有標(biāo)本均由2位消化內(nèi)科專家以及2位病理科專家進(jìn)行內(nèi)鏡下形態(tài)與病理組織學(xué)診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有家族性腺瘤性息肉史；(2)有惡性腫瘤病史；(3)有內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病史；(4)合并其他系統(tǒng)慢性器官功能衰竭。所有入選者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

將新鮮組織標(biāo)本置于凍存管中，保存在液態(tài)氮低溫環(huán)境中。標(biāo)本放入勻漿專用管中，加入TRIzol試劑1 mL，研磨成漿(6 500 r/min，震動(dòng)15 s)，移至1.5 mL離心管中裂解10 min。加入氯仿0.2 mL，顛倒混勻數(shù)次，室溫放置5 min，高速離心(12 000 r/min，15 min)，可見分成三相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，加入異丙醇0.4 mL，混勻后靜置(4 ℃，10 min)。高速離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)，棄去上清液，加入75%乙醇1 mL，混勻后再次高速離心(4 ℃，10 000 r/min，10 min)，重復(fù)本步驟1次。棄上清液，空氣中干燥10 min，將沉淀溶于20 μL DEPC水中，取溶解后的液體 5 μL，剩余RNA溶液暫時(shí)放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。低溫環(huán)境下配制反應(yīng)混合液，去除總RNA中的基因組DNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以獲得的cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測DLC-1 mRNA和FAK mRNA的表達(dá)水平。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組的DLC-1 mRNA表達(dá)水平比較

采用RT-PCR法對DLC-1 mRNA進(jìn)行定量檢測，正常黏膜組、腺瘤組、結(jié)腸癌組的DLC-1 mRNA相對表達(dá)量分別為0.889±0.090、0.614±0.071、0.216±0.059，呈逐漸降低趨勢，多組間比較結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=624，P<0.001)。組間兩兩比較結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組與腺瘤組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.77，P<0.001)，腺瘤組與正常黏膜組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.36，P<0.001)，結(jié)腸癌組與正常黏膜組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=35.12，P<0.001)。見圖1。

圖1 3組的DLC-1 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 3組的FAK mRNA表達(dá)水平比較

采用RT-PCR法對FAK mRNA進(jìn)行定量檢測，正常黏膜組、腺瘤組、結(jié)腸癌組的FAK mRNA相對表達(dá)量分別為0.674±0.219、1.329±0.375、3.136±0.454，呈逐漸升高趨勢，多組間比較結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=371，P<0.001)。組間兩兩比較結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組與腺瘤組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=19.29，P<0.001)，腺瘤組與正常黏膜組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.99，P<0.001)，結(jié)腸癌組與正常黏膜組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.29，P<0.001)。見圖2。

圖2 3組的FAK mRNA表達(dá)水平比較

2.3 3組中DLC-1 mRNA與FAK mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析對正常黏膜組、腺瘤組、結(jié)腸癌組中DLC-1 mRNA與FAK mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢驗(yàn)，分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果顯示，3組中DLC-1 mRNA與FAK mRNA的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.394，P<0.05；r=-0.672，P<0.001；r=-0.812，P<0.001)。見圖3。

圖3 3組中DLC-1 mRNA與FAK mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析 A 正常組 B 腺瘤組 C 結(jié)腸癌組

3 討論

早期結(jié)腸惡性腫瘤可通過內(nèi)鏡下切除病變組織或外科根治性手術(shù)治療，治愈率相對較高，而對于結(jié)腸進(jìn)展期腫瘤則療效欠佳[8]。在中國，人們對于結(jié)腸癌篩查的意識(shí)不強(qiáng)，且目前缺乏特異度、敏感度較高的生物學(xué)指標(biāo)，約有30%的患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，失去了治愈的機(jī)會(huì)，預(yù)后較差，5年生存率較低[9-10]。高?；颊呷裟鼙辉缙诎l(fā)現(xiàn)，并及早采取處理措施，可減緩甚至阻斷疾病惡化進(jìn)程，大幅度降低結(jié)腸癌的發(fā)病率，并可以在一定程度上減輕患者的經(jīng)濟(jì)壓力和心理負(fù)擔(dān)。

機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系密切，兩者共同維持平衡以保證各項(xiàng)生命活動(dòng)正常運(yùn)行，一旦平衡被打破則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞的異常增殖、分化，機(jī)體不能正常調(diào)控細(xì)胞組織的生長，最終可能導(dǎo)致腫瘤的不可控發(fā)展。DLC-1定位于局部黏著斑，因此要發(fā)揮其腫瘤抑制作用，對局部黏著斑的定位是必需的[11]。DLC-1可廣泛表達(dá)于多種正常組織器官中，并且主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。DLC-1的定位不同，其發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng)亦不相同，其定位于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖及遷移的作用，定位于細(xì)胞核則發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用[12]。本研究中，正常黏膜組、腺瘤組、結(jié)腸癌組的DLC-1 mRNA相對表達(dá)量呈逐漸降低趨勢，提示該基因可能在結(jié)腸腺瘤癌變進(jìn)展中發(fā)揮負(fù)性調(diào)控的作用，在某種因素作用下，其表達(dá)受到抑制或活性作用降低，抗腫瘤效應(yīng)隨之減弱，細(xì)胞不能進(jìn)入正常的凋亡程序，最終發(fā)展為惡性腫瘤。本研究結(jié)果顯示，DLC-1有望成為預(yù)測結(jié)腸腺瘤癌變風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物，并且可能可以通過調(diào)控該基因的表達(dá)活性，在一定程度上阻止結(jié)腸腺瘤癌變，為臨床上結(jié)腸癌的早期發(fā)現(xiàn)、及早治療提供選擇，以改善患者的預(yù)后。

FAK是一種非受體型酪氨酸激酶，位于細(xì)胞內(nèi)黏著斑部位，其在整合素信號刺激下被激活后，會(huì)引起一系列下游信號分子共同活化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)，最終對細(xì)胞的增殖、遷移和抑制凋亡起促進(jìn)作用[13]。研究顯示，在某些因素作用下，F(xiàn)AK可過度表達(dá)或活性增強(qiáng)，并且這種改變與惡性腫瘤的多種生物學(xué)過程有關(guān)，包括腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗凋亡等過程[14]。本研究中，正常黏膜組、腺瘤組、結(jié)腸癌組的FAK mRNA相對表達(dá)量呈逐漸升高趨勢，結(jié)腸癌組的FAK mRNA相對表達(dá)量顯著高于正常黏膜組和腺瘤組，故認(rèn)為該基因的高表達(dá)可能是結(jié)腸腺瘤發(fā)生癌變的機(jī)制之一，早期采取措施干擾該基因過表達(dá)，可能能夠延緩甚至阻斷結(jié)腸腺瘤的癌變進(jìn)程。因此，進(jìn)一步研究FAK基因的具體作用機(jī)制，可能具有重要的臨床意義。

本研究對3組中DLC-1 mRNA與FAK mRNA的表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示3組中兩者的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)性，F(xiàn)AK mRNA的表達(dá)顯著升高，而DLC-1 mRNA的表達(dá)顯著下降，由此認(rèn)為DLC-1與FAK共同參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，且兩者在此過程中相互拮抗，DLC-1可能是FAK的上級調(diào)控位點(diǎn)，處于主導(dǎo)地位，可能直接或間接影響FAK的表達(dá)，這與Kim等[15]的研究結(jié)果相符，DLC-1基因表達(dá)可使FAK脫磷酸化失去活性，還會(huì)對黏著斑的形成發(fā)揮抑制作用，使惡變細(xì)胞的黏附性降低，從而發(fā)生凋亡。由于結(jié)腸黏膜癌變進(jìn)程涉及的分子機(jī)制十分復(fù)雜，且與多種因素有關(guān)，對于結(jié)腸惡性腫瘤的相關(guān)研究成果仍十分有限，尚未完全揭示病變機(jī)制，本研究結(jié)果尚需大量臨床研究的驗(yàn)證。