丁銀蓉 劉 揚(yáng) 黃秀芹 葉星照 姚明亞 汪 莉

結(jié)直腸癌是中國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，確診時(shí)的疾病分期是決定患者預(yù)后的主要因素之一[1]。早期結(jié)直腸癌的5年生存率高于70%，若發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，則5年生存率為10%～20%[2]。隨著中國(guó)居民醫(yī)療條件的改善，人們的健康體檢意識(shí)也逐漸提高，早期結(jié)直腸癌的檢出率有所升高，但檢出率及生存率依然顯著低于日韓等國(guó)[3]。結(jié)腸鏡是目前篩查、診斷結(jié)直腸癌的最佳手段，但其屬于有創(chuàng)性檢查，難以在體檢人群中廣泛開(kāi)展[4]；目前已發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物的特異度較低，難以單獨(dú)作為惡性腫瘤的診斷依據(jù)[5]。因此，臨床中迫切需要尋找敏感度及特異度更高的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)。近年來(lái)，多種循環(huán)微RNA(miRNA)被發(fā)現(xiàn)可作為惡性腫瘤的潛在生物標(biāo)志物，具有高穩(wěn)定性、易于獲取及可重復(fù)采樣的特點(diǎn)，有望成為理想的生物標(biāo)志物[6]。miR-23a-3p、miR-376c-3p分別屬于miR-23家族和miR-376家族，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-23a在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高[7-8]，但關(guān)于其亞型miR-23a-3p的相關(guān)報(bào)道較少；目前有關(guān)miR-376c-3p與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究?jī)H局限于結(jié)直腸癌細(xì)胞株，提示miR-376c-3p的表達(dá)下調(diào)可能與結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性侵襲表型相關(guān)[9]，兩者在結(jié)直腸癌患者外周血循環(huán)中的表達(dá)水平以及對(duì)結(jié)直腸癌診斷方面的作用仍有待進(jìn)一步探討。本研究探討了結(jié)直腸癌患者血清miR-23a-3p、miR-376c-3p表達(dá)的臨床意義及其與患者預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2012年1月至2019年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均符合《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017年版)》[10]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均行根治性手術(shù)治療；(3)首次診斷并治療；(4)術(shù)前未行放射、化學(xué)治療等抗腫瘤治療；(5)病歷資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)；(2)合并其他急慢性感染性疾病；(2)合并全身其他系統(tǒng)的惡性腫瘤。共有78例結(jié)直腸癌患者被納入研究，收集患者的病歷資料及手術(shù)相關(guān)記錄，包括腫瘤直徑、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、靜脈侵犯、腹膜播散、肝轉(zhuǎn)移、Duke′s分期等。同時(shí)，選擇同期在本院體檢的60位健康志愿者作為健康對(duì)照組。78例患者中，男性54例，女性24例，年齡為41～75歲，平均年齡為(62.8±10.4)歲；健康對(duì)照組中，男性41例，女性19例，年齡為43～78歲，平均年齡為(60.7±12.5)歲。兩組受試者在性別、年齡方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。所有受試者對(duì)本研究知情同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 外周血miR-23a-3p、miR-376c-3p表達(dá)水平檢測(cè)

患者入院后，抽取肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血漿后低溫凍存；健康志愿者在體檢時(shí)采用同樣方法獲取血液標(biāo)本。參照總RNA快速抽提試劑盒[購(gòu)自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司]說(shuō)明書(shū)提取總RNA，檢測(cè)RNA濃度與純度。應(yīng)用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自日本Takara公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用RT-PCR檢測(cè)miR-23a-3p、miR-376c-3p的相對(duì)表達(dá)量。PCR中miR-23a-3p、miR-376c-3p的引物序列見(jiàn)表1，引物均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。qPCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，總計(jì)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。以U6作為內(nèi)參基因，計(jì)算Ct值，采用2-△△Ct法檢測(cè)外周血miR-23a-3p、miR-376c-3p的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3 隨訪

采用門(mén)診形式進(jìn)行定期隨訪。術(shù)后第1年，每3個(gè)月門(mén)診隨訪1次，之后每6個(gè)月隨訪1次，直至隨訪終點(diǎn)或研究結(jié)束?？傮w生存期(OS)定義為從隨機(jī)化開(kāi)始至因任何原因死亡的時(shí)間。無(wú)病生存期(DFS)定義為從隨機(jī)化開(kāi)始至疾病復(fù)發(fā)或因任何原因死亡的時(shí)間。隨訪截止時(shí)間為2020年1月31日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清miR-23a-3p、miR-376c-3p的表達(dá)水平

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，健康對(duì)照組和結(jié)直腸癌組中miR-23a-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為1.35±0.51、2.62±0.89，miR-376c-3p的相對(duì)表達(dá)量分別為3.56±0.78、1.22±0.35，兩組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者中，miR-23a-3p與miR-376c-3p的表達(dá)水平無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.101 2，P=0.374 7)。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組中miR-23a-3p、miR-376c-3p的表達(dá)水平比較 A 兩組血清miR-23a-3p的相對(duì)表達(dá)量 B 兩組血清miR-376c-3p的相對(duì)表達(dá)量 C 結(jié)直腸癌組中血清miR-23a-3p與miR-376c-3p表達(dá)的相關(guān)性

2.2 miR-23a-3p、miR-376c-3p的表達(dá)水平對(duì)患者臨床病理參數(shù)的影響

結(jié)直腸癌組患者血清miR-23a-3p、miR-376c-3p的中位表達(dá)水平分別為2.25、1.14，高于中位表達(dá)水平定義為高表達(dá)組，低于或等于中位表達(dá)水平定義為低表達(dá)組。單因素分析顯示，miR-23a-3p高表達(dá)對(duì)患者的靜脈侵犯、肝轉(zhuǎn)移、Duke′s分期有明顯消極影響(P<0.05)，即Duke′s分期越高、存在靜脈侵犯或肝轉(zhuǎn)移，患者血清miR-23a-3p的表達(dá)水平就越高。miR-376c-3p低表達(dá)對(duì)患者的腫瘤分化程度、靜脈侵犯、Duke′s分期有明顯消極影響(P<0.05)，即Duke′s分期越高、腫瘤分化程度越低、存在靜脈侵犯，患者血清miR-376c-3p表達(dá)水平就越低。具體見(jiàn)表2。

表2 miR-23a-3p、miR-376c-3p的表達(dá)水平對(duì)患者臨床病理參數(shù)的影響/例(%)

2.3 miR-23a-3p表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系

Log-rank生存分析顯示，miR-23a-3p高表達(dá)組患者的OS(χ2=4.55，P=0.032)、DFS(χ2=7.231，P=0.007)均顯著低于miR-23a-3p低表達(dá)組，表明miR-23a-3p的表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者的生存有顯著影響，miR-23a-3p表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-23a-3p表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系 A 與OS的關(guān)系 B 與DFS的關(guān)系

2.4 miR-376c-3p表達(dá)水平與患者生存率的影響

Log-rank生存分析顯示，miR-376c-3p低表達(dá)組患者的OS(χ2=4.798，P=0.028)、DFS(χ2=3.597，P=0.042)均顯著低于miR-376c-3p高表達(dá)組，表明miR-376c-3p的表達(dá)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者的生存有顯著影響，miR-376c-3p表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差。見(jiàn)圖3。

圖3 miR-376c-3p表達(dá)水平與患者生存率的關(guān)系 A 與OS的關(guān)系 B 與DFS的關(guān)系

2.5 影響結(jié)直腸癌患者OS、DFS的Cox回歸分析

Cox回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤T分期、Duke′s分期、miR-23a-3p表達(dá)水平、miR-376c-3p表達(dá)水平是影響患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)；Duke′s分期、miR-23a-3p表達(dá)水平、miR-376c-3p表達(dá)水平是影響患者DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表3 影響結(jié)直腸癌患者OS的Cox回歸分析

表4 影響結(jié)直腸癌患者DFS的Cox回歸分析

3 討論

早期結(jié)腸癌缺乏特異性癥狀，導(dǎo)致許多患者錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的現(xiàn)行指南強(qiáng)調(diào)了非侵入性診斷工具的重要性，如糞便免疫化學(xué)檢測(cè)、高敏感度糞便潛血檢測(cè)和CT掃描等[11]，而目前中國(guó)的結(jié)腸癌篩查仍然高度依賴于對(duì)危險(xiǎn)人群行結(jié)腸鏡檢查。由于結(jié)腸鏡檢查屬于侵入性檢查，許多無(wú)癥狀的高危人群存在明顯的排斥心理，因此迫切需要找到一種新的無(wú)創(chuàng)性的診斷方法。循環(huán)miRNA檢測(cè)已被認(rèn)為是多種腫瘤的有效的無(wú)創(chuàng)篩查方法，關(guān)于循環(huán)miRNA在結(jié)腸癌中表達(dá)意義的相關(guān)研究目前也已展開(kāi)。miR-23a-3p在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，Qin等[12]利用GSE61741芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，血清miR-23a-3p是結(jié)腸癌診斷的可靠標(biāo)志物，與miR-663a聯(lián)合診斷時(shí)AUC大于0.800，提示以此為基礎(chǔ)構(gòu)建評(píng)分系統(tǒng)區(qū)分腫瘤患者與一般人群是可靠和穩(wěn)定的。miR-376c-3p是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，在多種腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出抑瘤效應(yīng)，但目前關(guān)于miR-376c-3p在結(jié)腸癌患者血清或組織中表達(dá)的報(bào)道較少。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)患者血漿中miR-23a-3p、miR-376c-3p的表達(dá)水平，以期為結(jié)腸癌的無(wú)創(chuàng)診斷提供新思路和新方法。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者中miR-23a-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，miR-376c-3p的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，表明兩者在結(jié)直腸癌患者外周血中表達(dá)水平均存在明顯異常，但表達(dá)趨勢(shì)相反，這可能意味著miR-23a-3p、miR-376c-3p對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著相反的作用，即miR-23a-3p發(fā)揮促癌基因的效應(yīng)，而miR-376c-3p可能具有抑癌基因作用。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miR-23a-3p高表達(dá)對(duì)患者的靜脈侵犯、肝轉(zhuǎn)移、Duke′s分期有明顯不良影響，而miR-376c-3p低表達(dá)對(duì)患者的腫瘤分化程度、靜脈侵犯、Duke′s分期有明顯不良影響。提示miR-23a-3p高表達(dá)、miR-376c-3p低表達(dá)可導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)的惡化。

腫瘤臨床試驗(yàn)中常用OS評(píng)價(jià)藥物的療效[13]，當(dāng)患者的預(yù)期生存時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，它通常是首選終點(diǎn)。OS突出的優(yōu)點(diǎn)在于記錄方便，無(wú)論是院內(nèi)還是院外，較容易確定患者的死亡日期。DFS常用于根治性手術(shù)或放射治療后的輔助治療研究，目前為結(jié)腸癌輔助治療的主要審批基礎(chǔ)。本研究同時(shí)記錄了患者的OS及DFS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p高表達(dá)組患者的OS、DFS顯著低于低表達(dá)組，而miR-376c-3p低表達(dá)組患者的OS、DFS顯著低于高表達(dá)組，這與臨床病理參數(shù)分析的趨勢(shì)一致。周燕等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌患者組織中miR-23a-3p呈明顯高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及TNM 分期相關(guān)，可用于輔助診斷肺腺癌。這與本研究中miR-23a-3p的表達(dá)趨勢(shì)及對(duì)患者預(yù)后的影響相似?，F(xiàn)階段關(guān)于miR-376c-3p的研究主要局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，張林等[15]在人胃腸道間質(zhì)瘤GIST-T1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p可以間接調(diào)控CASP-7的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，miR-376c-3p低表達(dá)同樣是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良的重要信號(hào)，扮演著抑瘤基因角色。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者血清miR-23a-3p表達(dá)水平明顯升高，miR-376c-3p水平明顯降低，且兩者表達(dá)水平均對(duì)患者預(yù)后有顯著影響，可作為潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。