劉 玲，程 明，，唐仕成，鄭 丹，柯皓天，李瓊秀

（1.四川省絲綢工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610031； 2.四川省絲綢科學(xué)研究院，四川 成都 610031）

四川幅員遼闊，自然環(huán)境復(fù)雜多樣，擁有豐富的桑樹資源，一些科研單位利用分子標(biāo)記輔助育種、輻射育種、化學(xué)誘變等方法選育了大量桑樹品種［1］，為蠶桑生產(chǎn)作出了很大貢獻(xiàn)。四川省絲綢科學(xué)研究院長期致力于桑樹育種及其分子生物學(xué)研究，目前已育成了人工四倍體桑品種團(tuán)桑6號(hào)［2］和團(tuán)桑 11號(hào)［3］、果桑品種團(tuán)桑 9 號(hào)［4］，它們分別于2013年、2013年和2016年通過了四川省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。目前在四川省絲綢科學(xué)研究院的桑樹資源圃中保存著百余份種質(zhì)資源，其中團(tuán)桑2號(hào)、團(tuán)桑3號(hào)、團(tuán)桑4號(hào)、團(tuán)桑B號(hào)、團(tuán)桑5號(hào)、團(tuán)桑10號(hào)、團(tuán)桑12號(hào)、團(tuán)桑13號(hào)和團(tuán)桑14號(hào)已有選育報(bào)告但未審定，團(tuán)桑1號(hào)、團(tuán)桑3A號(hào)、團(tuán)桑7號(hào)、團(tuán)桑8號(hào)、團(tuán)桑15號(hào)和團(tuán)桑16號(hào)作為育種材料保存。為了更好地了解并利用這些資源，本研究采用ISSR分子標(biāo)記對18份團(tuán)桑資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料取自四川省絲綢科學(xué)研究院資源圃（表1）。

表1 供試材料表Table 1 Name of materials used

1.2 DNA提取及質(zhì)量檢測

桑樹基因組DNA采用稍加改進(jìn)的CTAB法［5］，從0.15 g硅膠干燥的桑葉中提取。取3 μL提取到的DNA，在1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，電泳完畢后先后用紫外反射透射儀和微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA的質(zhì)量和濃度，將合格的DNA置于-20℃保存。

1.3 ISSR引物來源及篩選

參考英屬哥倫比亞大學(xué)2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR在桑樹方面的研究結(jié)果［6］，選擇42個(gè)引物，由上海生工生物股份有限公司合成。以2份桑種質(zhì)基因組DNA為模板，對42個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增條帶多且清晰的引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 ISSR-PCR反應(yīng)及產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)在Thermal Cycler（上海山富科學(xué)儀器有限公司）上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系（10 μL）如表2，PCR反應(yīng)程序參照參考文獻(xiàn)［6］。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，用紫外反射透射儀觀察并拍照保存，用于后續(xù)的數(shù)據(jù)整理。

1.5 數(shù)據(jù)分析

手工記錄不同遷移率條帶。同一遷移率，根據(jù)條帶的有無分別記為“1”和“0”，在Excel中形成數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)Nei's方法［7］，用Popgene32軟件［8］評價(jià)引物的擴(kuò)增效果，并采用非加權(quán)組平均法UPGMA對24份供試材料進(jìn)行聚類分析。

表2 PCR反應(yīng)體系（10 μL）Table 2 PCR reaction system（10 μL）

2 結(jié)果與分析

2.1 24份供試?；蚪MDNA的ISSR擴(kuò)增的多態(tài)性

從42條引物中篩選出9條擴(kuò)增條帶清晰的引物進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)，9條引物共擴(kuò)增出56條清晰條帶，其中55條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為98.21%；平均每條引物擴(kuò)增出6.22條條帶，其中6.11條為多態(tài)性條帶；引物ID8擴(kuò)增出的條帶數(shù)最多為8條，多態(tài)性100%，引物ID6擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少為4條，也全部具有多態(tài)性；所有引物擴(kuò)增出的片段大小為200～2000 bp（圖1，表3）。

表3 9條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果Table 3 Amplification results of 9 ISSR primers

2.2 24份供試?；贗SSR分子標(biāo)記的聚類分析

以9條引物擴(kuò)增的55條多態(tài)性條帶為基礎(chǔ)，利用Popgene32軟件計(jì)算每份種質(zhì)桑間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。結(jié)果表明，24份供試桑的遺傳相似系數(shù)為0.4643～0.9107，遺傳距離為0.0935～0.7673。聚類分析圖（圖2）中，首先分出的是團(tuán)桑14號(hào)，其余23份桑聚為一個(gè)大支，這一大支分為5個(gè)分支：團(tuán)桑1號(hào)、團(tuán)桑11號(hào)、團(tuán)桑6號(hào)、團(tuán)桑9號(hào)、團(tuán)桑10號(hào)和團(tuán)桑7號(hào)在分支①；團(tuán)桑2號(hào)、團(tuán)桑3號(hào)、團(tuán)桑4號(hào)、團(tuán)桑5號(hào)、團(tuán)桑8號(hào)、團(tuán)桑12號(hào)、白桑、蒙桑、團(tuán)桑B號(hào)和華桑在分支②；團(tuán)桑13號(hào)、團(tuán)桑15號(hào)和山桑在分支③；團(tuán)桑16號(hào)、雞桑在分支④；團(tuán)桑3A號(hào)和川桑在分支⑤。

3 小結(jié)與討論

采用9條ISSR引物對18份團(tuán)桑資源和6份野生桑進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出56條條帶，其中多態(tài)性條帶55條，占98.21%，平均每條引物擴(kuò)增出6.22條條帶。24份供試桑的遺傳相似系數(shù)為0.4643～0.9107，遺傳距離為0.0935～0.7673。在UPGMA聚類分析中，團(tuán)桑14號(hào)首先被分出，其余的23份桑聚為一個(gè)大支。團(tuán)桑14號(hào)是盤桑2號(hào)（是四川省三臺(tái)蠶種場從一株30年樹齡的老桑樹上采穗，進(jìn)行嫁接繁殖，從中選出的豐產(chǎn)性能好、桑椹多而大、春季葉片大的葉果兼用桑品種［9］）經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)得到的，其單獨(dú)被分出，說明其遺傳背景與其他23份桑資源不同。

團(tuán)桑6號(hào)和團(tuán)桑9號(hào)聚在分支①中，這兩個(gè)品種有相同親本。團(tuán)桑6號(hào)是以二倍體塘10×倫109的雜種實(shí)生苗為材料，用秋水仙堿溶液誘導(dǎo)其體細(xì)胞染色體加倍，經(jīng)無性固定育成人工四倍體桑品種（2n=4x=56）［2］；團(tuán)桑9號(hào)系從塘10×倫109 F1雜交桑的果桑株系中選出的果用桑品種［4］。

團(tuán)桑13號(hào)系將二倍體塘10×倫109 F1幼苗誘導(dǎo)為四倍體，與二倍體四川花桑雜交而育成的雜種優(yōu)勢強(qiáng)、產(chǎn)葉量高、葉質(zhì)優(yōu)、生長旺盛的人工三倍體［10］，與團(tuán)桑15號(hào)、山桑聚在分支③中，說明團(tuán)桑13號(hào)、團(tuán)桑15號(hào)、山桑的親緣關(guān)系近。

團(tuán)桑4號(hào)和團(tuán)桑B號(hào)系四川省絲綢科學(xué)研究院從1.2萬株豐馳桑中，經(jīng)過初選、復(fù)選、擴(kuò)大繁殖、田間測試中選出的［11］。團(tuán)桑4號(hào)葉形肥大、產(chǎn)葉量高、全開雌花、結(jié)果多，可作為葉果兼用品系；團(tuán)桑B號(hào)葉片較肥大、產(chǎn)葉量高、開少量雄花。這兩個(gè)桑資源來源相同，都聚在分支②中。

聚類結(jié)果還說明團(tuán)桑12號(hào)與白桑的親緣關(guān)系近，團(tuán)桑B號(hào)與華桑的親緣關(guān)系近，團(tuán)桑16號(hào)與雞桑的親緣關(guān)系近，團(tuán)桑3A號(hào)與川桑的親緣關(guān)系近。