林勁草，肖 莉，吳酬飛，張紹勇，楊惠寧，張立欽,

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州313000；3. 湖州師范學(xué)院 浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州 313000）

喜樹堿(camptothecin, CPT)是一種細(xì)胞毒性喹啉類生物堿，1966年由WALL等[1]首次從喜樹Camptotheca acuminata中分離得到。作為植物源農(nóng)藥的喜樹堿是一種昆蟲不育劑[2]，并且對(duì)昆蟲有觸殺和胃毒的作用[3]；對(duì)黃瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea、番茄灰霉病Botrytis cinerea等也有較好的防治效果[4]。因此，喜樹堿在農(nóng)業(yè)病蟲害防治方面有較大的應(yīng)用開發(fā)潛力。馬比木Nothapodytes pittosporoides是茶茱萸科Icacinaceae假柴龍樹屬Nothapodytes灌木，又名海桐馬比木、公黃珠子、追風(fēng)傘[5]。主產(chǎn)于貴州、湖南、湖北、四川等地，入藥能除濕、祛風(fēng)、理氣，主治濕痹、浮腫、疝氣[6?7]。在馬比木植株中，其根、莖、枝、葉、果實(shí)和種子中都含有喜樹堿[8?10]。隨著市場(chǎng)對(duì)喜樹堿需求量不斷增加，馬比木作為喜樹堿藥源, 具有原料成本低的優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物喜樹的最佳替代品，已成為提取喜樹堿的重要原料[11?13]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于馬比木中喜樹堿提取工藝的研究較少，且基本采用的均為正交設(shè)計(jì)優(yōu)化。本研究以馬比木為原料，以喜樹堿提取率作為優(yōu)化指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)喜樹堿的提取工藝進(jìn)行了研究，以期為喜樹堿提取工藝的優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀 (型號(hào) 1260，Agilent)；高速多功能粉碎機(jī) (800Y-304，旭曼)；超聲波清洗器(DS-080S，工作頻率40 kHz，東森)；電子分析天平(ME204E，METTLER TLLEDO)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 馬比木 (購(gòu)于貴州中藥材市場(chǎng), 主要為枝和葉)，曬干后粉碎過 60 目篩。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 甲醇 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析純)；甲醇 (北京百靈威科技有限公司，色譜純)；乙腈(北京百靈威科技有限公司，色譜純)；水為超純水；喜樹堿對(duì)照樣品(純度≥98%，合肥博美有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照樣品溶液制備 稱取喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)樣品 10.50 mg，置于容量瓶中，甲醇溶解稀釋、定容至50 mL，配制質(zhì)量濃度為0.21 g·L?1的喜樹堿對(duì)照樣品溶液，搖勻，備用。

1.2.2 樣品溶液制備 稱取粉碎后馬比木粉末 5.06 g，置于錐形瓶中，加入甲醇 100 mL，室溫下超聲30 min，0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱 Alltima C18(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈∶水=25∶75(V∶V)；流速1.0 mL·min?1；檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取對(duì)照樣品溶液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容至10 mL，按照1.2.3色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。以喜樹堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 馬比木中喜樹堿提取率測(cè)定 稱取粉碎后的馬比木粉末 10.16 g，置于錐形瓶中，加入甲醇 100 mL，溫度條件30 ℃，超聲30 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液按照1.2.3色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)以下公式計(jì)算喜樹堿提取率(R1)：R1=CV/1 000M×100%。其中：C表示提取液中喜樹堿質(zhì)量濃度(g·L?1)，V表示溶劑體積(mL)，M表示藥材質(zhì)量(g)。

1.2.6 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 稱取粉碎后馬比木粉末10 g，置于錐形瓶中，將3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素：甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、液料比中2個(gè)固定不變，1個(gè)作為變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液在1.2.3色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，平行3次，取平均值。

1.2.7 Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇超聲時(shí)間 30 min、甲醇體積分?jǐn)?shù)80% 和 液 料 比 20 mL·g?1(溶 劑 體 積 ∶藥 材 質(zhì)量=100∶5)3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以喜樹堿提取率為指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化提取條件。因素水平如表1所示。

1.2.8 數(shù)據(jù) 處理及 分析 響應(yīng) 面實(shí)驗(yàn) 數(shù) 據(jù)采用Designer-Expert 8.0軟件進(jìn)行處理，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

表 1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

為準(zhǔn)確測(cè)量馬比木中喜樹堿的質(zhì)量濃度，建立高效液相色譜法，以喜樹堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，計(jì)算得線性回歸方程為：y=9×106x+902 381，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，喜樹堿質(zhì)量濃度的線性范圍為 0.021～0.189 g·L?1。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果果

2.2.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)喜樹堿提取率的影響 在超聲時(shí)間為 30 min，液料比為 20 mL·g?1時(shí)，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、80%、90%的條件下進(jìn)行提取。由圖1A可知：隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，喜樹堿的提取率先增大后減小。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)超過80%時(shí)，提取率開始減小。提高甲醇體積分?jǐn)?shù)有利于喜樹堿的提取，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)＞80%時(shí)，喜樹堿提取率反而降低，可能由于隨甲醇體積分?jǐn)?shù)的提高，提取液極性減小，其中某些雜質(zhì)的溶出增加，干擾了馬比木的檢測(cè)，提取率下降。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，提取率達(dá)最大值，因此選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%為宜。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)喜樹堿提取率的影響 在甲醇體積分?jǐn)?shù)為 80%，液料比為 20 mL·g?1時(shí)，選取超聲時(shí)間分別為10、20、30、40和50 min的條件下進(jìn)行提取。由圖1B可知：隨超聲時(shí)間的增加，喜樹堿提取率先增加后減小，在超聲時(shí)間為30 min時(shí)喜樹堿提取率最高。這是因?yàn)殡S超聲時(shí)間增加，喜樹堿發(fā)生氧化的概率也會(huì)增大，使提取率降低，所以選擇提取時(shí)間為30 min適宜。

2.2.3 液料比對(duì)喜堿提取率的影響 在超聲時(shí)間為30 min，甲醇體積分?jǐn)?shù)為 80% 時(shí)，選取液料比分別為12、16、20、24和28 mL·g?1的條件進(jìn)行提取。由圖1C可知：隨著液料比由小到大，喜樹堿提取率先增加后減小，提取率最高的液料比為20 mL·g?1。隨著溶劑的增多，馬比木與溶劑之間能充分接觸，有利于馬比木溶解于溶劑中，當(dāng)液料比超過20 mL·g?1后，已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，再加就稀釋了，喜樹堿提取率下降，所以選擇液料比20 mL·g?1較適宜。

圖 1 不同影響因素下喜樹堿提取率的變化Figure 1 Change of the extraction rate of camptothecin under different influencing factors

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，初步選定甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲時(shí)間30 min和液料比20 mL·g?1為最佳提取條件，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示。

以喜樹堿提取率為指標(biāo)(R1)，采用Designer-Expert 8.0軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到方程：R1=0.11?8.500×10?3A+6.125×10?3B+4.375×10?3C+7.000×10?3AB?0.014AC+0.015BC?0.026A2?0.024B2?0.030C2。其中：A表示甲醇體積分?jǐn)?shù)，B表示超聲時(shí)間，C表示液料比。多元回歸模型的方差分析見表3。由ANVOA分析可知：在考察指標(biāo)的二項(xiàng)式方程中，模型的F為24.59(P=0.000 2＜0.001)，說明回歸模型極顯著；擬合相關(guān)系數(shù)R2=0.969 3，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.929 9，失擬項(xiàng)顯著(P=0.034 3＜0.05)。該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較?。恍旁氡容^高，為12.503＞4.000，說明該多元回歸模型可預(yù)測(cè)馬比木中喜樹堿的最優(yōu)提取工藝條件。

顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)對(duì)馬比木中喜樹堿提取率的影響順序依次為A、B、C。甲醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)A2、超聲時(shí)間的二次項(xiàng)B2、液料比的二次項(xiàng)C2對(duì)馬比木中喜樹堿的提取率有極顯著影響(P＜0.001)；超聲時(shí)間和液料比的交互項(xiàng)BC對(duì)馬比木中喜樹堿的提取率有極顯著影響(P＜0.01)；甲醇體積分?jǐn)?shù)A與甲醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互項(xiàng)AC對(duì)馬比木中喜樹堿的提取率有顯著影響(P＜0.05)；超聲時(shí)間B、液料比C、甲醇體積分?jǐn)?shù)與超聲時(shí)間的交互項(xiàng)AB對(duì)馬比木中喜樹堿提取率的影響不顯著(P＞0.05)。

表 2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和結(jié)果Table 2 Box-Behnken Design tests and results

表 3 響應(yīng)面回歸模型 ANOVA 分析結(jié)果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

相對(duì)于3個(gè)單因素的其中2個(gè)因素，采用Box-Behnken繪制三維響應(yīng)面圖，兩兩因素的交互作用對(duì)馬比木中喜樹堿提取率的影響見圖2。由圖2A可見：甲醇體積分?jǐn)?shù)A的曲面較陡峭，超聲時(shí)間B的曲面較平緩，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬比木中喜樹堿提取率的影響比超聲時(shí)間的影響大。由圖2B可見：甲醇體積分?jǐn)?shù)A的曲面較為陡峭，液料比C的曲面較為平緩，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)馬比木中喜樹堿提取率的影響比液料比大。由圖2C可見：超聲時(shí)間B的曲面較陡，液料比C的曲面較為平緩，表明超聲時(shí)間對(duì)馬比木中喜樹堿提取率的影響比液料比的影響大?？梢姡谶x擇的3個(gè)單因素中，甲醇體積分?jǐn)?shù)A對(duì)馬比木中喜樹堿的提取率的影響顯著，表現(xiàn)為其曲線較陡；在兩兩因素交互作用中，甲醇體積分?jǐn)?shù)與液料比的交互作用(AC)對(duì)馬比木中喜樹堿的提取率影響顯著，超聲時(shí)間與液料比的交互作用(BC)對(duì)馬比木中喜樹堿的提取率影響顯著。

2.4 最優(yōu)方案驗(yàn)證

根據(jù)模型預(yù)測(cè)，得到馬比木中喜樹堿提取的最優(yōu)工藝為：甲醇體積分?jǐn)?shù)46.4%，超聲時(shí)間26.1 min，液料比21.20 mL·g?1。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)得喜樹堿提取率分別為0.080 4%、0.082 6%、0.082 1%，與模型預(yù)測(cè)值接近，平均誤差3.2%，表明模型能較好地預(yù)測(cè)喜樹堿實(shí)際提取率。

圖 2 不同影響因素對(duì)喜樹堿提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 2 Response surface diagram of the effect of different influencing factors on camptothecin extraction rate

3 結(jié)論

本研究以馬比木為原料，以喜樹堿提取率作為優(yōu)化指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)因素，通過Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)17組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，在整個(gè)區(qū)域得到回歸方程，可以直觀反映出各個(gè)因素對(duì)喜樹堿提取率的影響。優(yōu)化的最優(yōu)工藝為：甲醇體積分?jǐn)?shù)46.4%，超聲時(shí)間 26.1 min，液料比 21.20 mL·g?1，喜樹堿提取率為 0.084 4%。3 次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：提取率平均誤差3.2%。說明本次建立的擬合模型較為成功，可以為馬比木中喜樹堿的提取應(yīng)用提供一定的參考。