張 靜，高 煊, 2，金 亮，王鴻輝，周細(xì)平

1. 河口生態(tài)安全與環(huán)境健康福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廈門大學(xué)嘉庚學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，福建 漳州 363105 2. 廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門 361102

引 言

蛋白質(zhì)作為重要的功能性生物大分子，在生物體的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝轉(zhuǎn)化、催化作用、信息傳遞和免疫反應(yīng)等生命活動(dòng)中扮演重要角色[1]。而這些生命活動(dòng)的發(fā)生大多涉及蛋白質(zhì)-配體的結(jié)合作用。因此，蛋白質(zhì)與配體結(jié)合作用的研究一直以來都是化學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)以及生物學(xué)等多種學(xué)科領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。

在研究蛋白質(zhì)和配體結(jié)合作用時(shí)，評(píng)價(jià)其結(jié)合作用的強(qiáng)弱具有重要意義。以藥物分子與生物體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的結(jié)合作用為例，其結(jié)合作用的強(qiáng)弱直接影響藥物在生物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特性[2]。評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)和配體結(jié)合作用強(qiáng)弱的重要參數(shù)是結(jié)合常數(shù)(Kb)。目前，多種分析方法可用以獲得蛋白質(zhì)-配體的Kb值，如光譜分析法 (熒光、紫外-可見吸收、圓二色、核磁共振和表面等離子體共振光譜法等)及非光譜分析法如平衡透析法、親和層析法、電化學(xué)方法、等溫滴定量熱法和分子對(duì)接法等[3]。其中，熒光光譜法因其靈敏度高、方便快速及成本低的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于蛋白質(zhì)和配體結(jié)合作用研究中。

利用熒光光譜法獲得蛋白質(zhì)和配體的結(jié)合常數(shù)，往往是通過測(cè)定配體對(duì)蛋白質(zhì)的熒光猝滅效應(yīng)，并借助分析方程對(duì)熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)分析來得到Kb值。在該過程中，因不同函數(shù)方程的適用范圍不同，在使用時(shí)應(yīng)據(jù)具體情況進(jìn)行選擇。而以往大量的研究常忽視了這一問題，一些方程被不加選擇地使用，使得不同研究者對(duì)相同目標(biāo)物的研究結(jié)果相異甚至大相徑庭[4]。那么，這其中必定有一些結(jié)果是存在問題的。然而，目前很少有研究透徹地對(duì)比分析不同函數(shù)方程的立腳點(diǎn)、適用范圍及其存在的缺陷，來幫助研究人員方便快速地選擇合適且有效的分析方程以避免錯(cuò)誤的數(shù)據(jù)分析。

鑒于此，本文擬對(duì)現(xiàn)有且常用的用于計(jì)算蛋白質(zhì)和配體結(jié)合常數(shù)的函數(shù)方程進(jìn)行對(duì)比分析。一方面，通過不同方程的推導(dǎo)過程來明確其使用前提和適用范圍。另一方面，選取人血清白蛋白質(zhì)(human serum albumin，HSA)-諾氟沙星(norfloxacin，NFX)結(jié)合反應(yīng)體系作為模型，在方程的實(shí)際應(yīng)用中考察選擇不適用的方程對(duì)所獲結(jié)果的影響。此外，我們還對(duì)比了不同分析方法獲得的HSA-NFX結(jié)合反應(yīng)的Kb值，來評(píng)估熒光光譜法計(jì)算Kb值的可靠性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

NFX(純度>98%)和HSA(純度>96%)均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。配制0.05 mol·L-1pH為7.40的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，并用其作溶劑，分別配制5.0×10-5mol·L-1的HSA儲(chǔ)備液及4.0×10-4mol·L-1的NFX儲(chǔ)備液，均置于4 ℃冰箱保存。其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

F-4600型熒光分光光度計(jì)(日立高新技術(shù)公司，日本)；UV-8000S紫外-可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 HSA-NFX反應(yīng)體系的配制

熒光猝滅實(shí)驗(yàn)體系：向一系列10 mL比色管中加入一定量HSA和NFX儲(chǔ)備液，并用PBS緩沖液定容至10 mL，使其中HSA濃度為5.0×10-6mol·L-1，NFX濃度分別為(0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0，150.0，200.0，250.0，300.0)×10-6mol·L-1。設(shè)置3組平行樣。

Job’s plot 實(shí)驗(yàn)體系：樣品中固定HSA和NFX總濃度為2.0×10-5mol·L-1，設(shè)置HSA的濃度分別為(0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，13.0，14.0，15.0，16.0，17.0，18.0，19.0，20.0)×10-6mol·L-1，NFX的濃度隨之變化。設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組，對(duì)照組溶液中僅含與樣品組濃度相同的HSA，而無NFX。設(shè)置3組平行樣。

1.2.2 熒光光譜測(cè)定

298 K下，使用 1 cm×1 cm 石英比色皿，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為282.0 nm，檢測(cè)HSA-NFX反應(yīng)體系在290～480 nm 范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜，掃描速度為1 200 nm·min-1，激發(fā)、發(fā)射狹縫均為5 nm。所得熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)均利用公式S1進(jìn)行內(nèi)濾效應(yīng)校正[4]。

1.2.3 吸收光譜測(cè)定

于298 K溫度下，掃描試液在190～450 nm范圍內(nèi)的紫外-可見吸收光譜，所得數(shù)據(jù)用于HSA-NFX反應(yīng)體系的熒光內(nèi)濾效應(yīng)校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光靜態(tài)猝滅數(shù)據(jù)分析方法的對(duì)比

熒光猝滅分為動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅，其分別由猝滅劑與熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)相互作用或猝滅劑抑制熒光團(tuán)激發(fā)態(tài)的形成所產(chǎn)生[5]。區(qū)分靜、動(dòng)態(tài)猝滅最有效的方法是測(cè)定熒光團(tuán)的壽命變化。本文所討論的計(jì)算Kb值的不同方法僅針對(duì)因熒光團(tuán)和猝滅劑間形成基態(tài)復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅過程。因此，據(jù)熒光壽命分析判定猝滅方式為靜態(tài)猝滅后才可參考本文選擇合適的計(jì)算方法。

基于蛋白質(zhì)-配體的復(fù)合物模型，并將蛋白質(zhì)-配體的結(jié)合劃分為1∶1和1∶n(n≥2)結(jié)合兩類，在支持信息S2部分詳細(xì)討論分析了利用熒光光譜數(shù)據(jù)計(jì)算蛋白質(zhì)和配體結(jié)合的Kb值的不同函數(shù)方程的推導(dǎo)過程及相應(yīng)的適用條件。由討論可知，判斷假設(shè)a蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物不再產(chǎn)生熒光，和假設(shè)b添加的配體濃度遠(yuǎn)大于蛋白質(zhì)濃度(超過10倍)是否成立是選取適用的函數(shù)方程的前提條件。為此，我們總結(jié)了蛋白質(zhì)-配體1∶1和1∶n結(jié)合時(shí)在不同情形下可選擇的分析方程，詳見表1。

2.2 不同數(shù)據(jù)分析方法在HSA-NFX熒光猝滅體系中的應(yīng)用

在選取上述方程計(jì)算HSA與NFX的結(jié)合常數(shù)前，需首先確定HSA與NFX的結(jié)合比。由圖1(a)可知，經(jīng)Job’s plot[6]擬合，兩條擬合線的交點(diǎn)處NFX的摩爾分?jǐn)?shù)XNFX≈0.5，表明HSA與NFX結(jié)合的化學(xué)計(jì)量數(shù)比為1∶1。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了不同濃度NFX對(duì)HSA的熒光猝滅情況[見圖1(b)]。由圖1(b)可知，當(dāng)NFX的濃度大于1.0×10-4mol·L-1時(shí)，HSA的熒光即基本被完全猝滅。由此判定，在HSA-NFX體系中，S2.1所提出的假設(shè)a成立，即HSA-NFX復(fù)合物不再產(chǎn)生熒光。

為討論需要，選取圖1(b)中NFX濃度為0至2.0×10-5mol·L-1時(shí)的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。在此條件下，S2.1中所提出的假設(shè)b是不成立的。此時(shí)，方程(S12)是計(jì)算HSA與NFX結(jié)合常數(shù)的最優(yōu)選擇，經(jīng)非線性擬合得到HSA與NFX的Kb值為5.0×104L·mol-1。如計(jì)算時(shí)未考慮假設(shè)b是否成立而選取方程(S6)，則經(jīng)擬合得到的Kb值為6.44×104L·mol-1，比使用方程(S12)得到的值大28.8%。

在以往較多的研究中，方程(S17)也常用以計(jì)算蛋白質(zhì)-配體1∶1結(jié)合時(shí)的Kb值(即默認(rèn)n=1)[7]。為對(duì)比，利用方程(S17)進(jìn)行擬合分析得到Kb值為4.48×106L·mol-1，這比由方程(S12)所得值高2個(gè)數(shù)量級(jí)。這是由于：(1)方程(S17)的使用前提為假設(shè)a和b均成立，而對(duì)于本文分析的HSA-NFX體系，假設(shè)a成立而假設(shè)b并不成立；(2)利用方程(S17)擬合時(shí)，利用擬合曲線的截距計(jì)算Kb值時(shí)涉及10的次方運(yùn)算，因此擬合過程中斜率n的微小變化就可引起Kb值較大的改變。在針對(duì)HSA與保泰松結(jié)合常數(shù)的研究中，利用方程(S17)擬合得到的Kb值比由最優(yōu)方程或其他分析方法獲得的值約低2個(gè)數(shù)量級(jí)[4]，這也展現(xiàn)了方程(S17)的缺陷對(duì)所得結(jié)果產(chǎn)生的較大影響，佐證了上述判斷。此外，同樣默認(rèn)n為1，利用方程(S24)擬合得到HSA-NFX體系的Kb值為7.43×104L·mol-1，該值比使用方程(S12)得到的值大48.6%。雖如此，利用方程(S24)計(jì)算Kb值的可靠性仍強(qiáng)于方程(S17)。

表1 蛋白質(zhì)-配體1∶1和1∶n結(jié)合時(shí)方程的選擇Table 1 Selection of equations for 1∶1 or 1∶n protein-ligand binding processes

圖1 (a)總濃度([HSA]+[NFX])為2.0×10-5 mol·L-1時(shí)HSA-NFX體系熒光猝滅的Job’s Plot; (b)不同濃度NFX存在下HSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度激發(fā)波長(zhǎng)=282 nm，發(fā)射波長(zhǎng)=332 nm

Ex=282.0 nm, Em=332.0 nm

綜上，在分析假設(shè)a成立的HSA-NFX熒光猝滅體系時(shí)，如直接選用基于假設(shè)b成立的方程，得到的Kb值將會(huì)存在一定的誤差；同時(shí)，應(yīng)用方程時(shí)一些等價(jià)的數(shù)學(xué)變化可能會(huì)引入較大的誤差，使所得結(jié)果明顯不可靠。這提示，在應(yīng)用上述方程計(jì)算Kb值時(shí)，應(yīng)按照其使用條件正確選擇。然而，令人擔(dān)憂的是，數(shù)據(jù)分析時(shí)不加選擇地使用上述方程的現(xiàn)象仍較為普遍。因此，一些文章中報(bào)道的Kb值很可能不能真實(shí)反映蛋白質(zhì)-配體間的真實(shí)親和力。

以往研究者在研究HSA與NFX的結(jié)合作用時(shí)，除了熒光光譜法，還利用表面等離子共振法、等溫滴定量熱法和親和毛細(xì)管電泳法來獲得Kb值。于此，我們對(duì)比了不同分析方法所獲得的結(jié)果(表2)。由表2可知，不同分析方法所得的HSA與NFX的Kb值主要集中在104L·mol-1這一量級(jí)。在這些分析方法中，等溫滴定量熱法通常被認(rèn)為是量化結(jié)合親和力的最準(zhǔn)確的方法之一，由其獲得的Kb值也在這一量級(jí)。文獻(xiàn)[5]利用熒光光譜法獲得Kb值，其數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他研究的結(jié)果(約高3個(gè)數(shù)量級(jí))。這是由于該文所設(shè)置的HSA和NFX濃度并不符合假設(shè)b，卻直接使用方程(S17)來擬合數(shù)據(jù)，放大了誤差，其所得結(jié)果的準(zhǔn)確性值得斟酌。此外，本文所得的Kb值(5.0×104L·mol-1)與等溫滴定量熱法所得結(jié)果[(3.49～3.85)×104L·mol-1]存在一定的差異，這是由于兩種方法所檢測(cè)的結(jié)合反應(yīng)過程中的表觀數(shù)據(jù)不同。熒光光譜法檢測(cè)的是HSA與NFX結(jié)合過程中HSA的熒光強(qiáng)度的變化，而除了與NFX的結(jié)合，還有其他不可控的因素(如NFX引起的HSA構(gòu)象變化)也會(huì)影響HSA的熒光強(qiáng)度。因此，利用熒光光譜法所獲得的Kb值與真實(shí)值仍存在一定的差異。而等溫滴定量熱法檢測(cè)的是HSA與NFX結(jié)合過程中體系的熱量變化，在理想條件下影響實(shí)驗(yàn)的因素是可控制的，因此其所得結(jié)果更為接近真實(shí)值。盡管如此，因熒光光譜法具有簡(jiǎn)便快速、靈敏度高和成本低的優(yōu)點(diǎn)，且還能獲得蛋白質(zhì)微觀層面的信息，故在蛋白質(zhì)-配體結(jié)合作用的研究中仍值得運(yùn)用。當(dāng)然，綜合利用多種分析方法來獲得和驗(yàn)證蛋白質(zhì)-配體結(jié)合的Kb值可獲得更為可靠的結(jié)果，值得推薦。

表2 不同分析方法所獲得的HSA-NFX體系的結(jié)合常數(shù)Table 2 The binding constant of HSA-NFX system obtained by different analytical techniques

3 結(jié) 論

利用熒光光譜法計(jì)算蛋白質(zhì)-配體結(jié)合的Kb值時(shí)，判定假設(shè)a和b是否成立是選取用于數(shù)據(jù)處理的最優(yōu)的函數(shù)方程的必要前提。如利用函數(shù)方程處理時(shí)忽略這一前提條件而選取了不適用的方程，將使計(jì)算出的Kb值偏離真實(shí)值，從而得到不可靠甚至明顯錯(cuò)誤的結(jié)果。然而，在已有的利用熒光光譜法計(jì)算蛋白質(zhì)和配體的Kb值的研究中，不加選擇地應(yīng)用函數(shù)方程的問題仍廣泛存在。因此，我們希望本文能有助于提高研究者對(duì)這一問題的認(rèn)識(shí)，從而在今后的工作中能避免因忽視該問題而獲得不可靠的數(shù)據(jù)。