肖 穎， 吳夢(mèng)琪， 張文清， 徐志珍， 夏 瑋

（華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院， 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

茯苓（Poria cocos）是一種高等擔(dān)子菌，寄生于松科植物的根莖上，埋于土壤下繁衍而成。茯苓是傳統(tǒng)藥食兩用中藥，有多個(gè)入藥部位，藥用茯苓指的是茯苓的干燥菌核，多為不規(guī)則、大小不一的白色塊狀。多糖是茯苓的主要成分，具有多種生物活性。根據(jù)分步提取的方法，可以從茯苓中分離出6 種多糖[1]，分別命名為PCS1、PCS2、PCS3-I、PCS3-II、PCS4-I 和PCS4-II。其中PCS1、PCS2 和PCS3-I 是含有D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-巖藻糖和D-木糖的雜多糖。PCS3-II、PCS4-I 和PCS4-II 主要由（1→3）-β-D-葡聚糖主鏈和少量（1→6）-β-D-葡聚糖支鏈組成[2]。茯苓多糖（PCPs）具有免疫調(diào)節(jié)的作用，有研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖不僅能促進(jìn)小鼠T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖以及增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，還能刺激免疫細(xì)胞釋放免疫因子，顯著提高小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫的能力。茯苓多糖無論是在藥用臨床領(lǐng)域還是食品保健品領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。

多糖的生物活性與多糖的糖基組成、糖苷鍵類型、糖基連接順序、支鏈情況、相對(duì)分子質(zhì)量以及特定的空間構(gòu)象等有著密切的關(guān)系[6]。在研究單糖組成對(duì)免疫活性的影響時(shí)，不能僅憑單糖的含量判斷，將含量較高的單糖成分認(rèn)定為對(duì)免疫活性貢獻(xiàn)最大的成分，而應(yīng)該通過數(shù)學(xué)建模的方法將指紋圖譜色譜峰與生物活性數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而研究各組分對(duì)生物活性的貢獻(xiàn)大小。用于相關(guān)性分析的數(shù)學(xué)建模方法有很多，其中常用的是灰色相關(guān)度分析[7]、典型相關(guān)分析[8]、主成分分析[9]、多元線性回歸分析[10]以及偏最小二乘法等[11]。正交偏最小二乘法在偏最小二乘法的基礎(chǔ)上結(jié)合了正交信號(hào)修正法，消除了與因變量無關(guān)的數(shù)據(jù)信息，不僅提高自變量與因變量的相關(guān)性，而且使得整個(gè)模型更加簡(jiǎn)潔可靠[12]。

本文通過將茯苓多糖單糖組成的指紋圖譜與小鼠巨噬細(xì)胞釋放的NO 的量相結(jié)合，采用正交偏最小二乘回歸分析的方法，建立色譜指紋圖譜與免疫活性之間的相關(guān)性模型。通過單糖組成的差異來反映各多糖含量的差異，研究單糖組成與免疫活性的相關(guān)性，根據(jù)相關(guān)系數(shù)的大小研究影響免疫活性的關(guān)鍵特征成分，為建立茯苓的質(zhì)量控制方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜（HPLC，安捷倫科技（中國(guó)）有限公司）；VS-840-1 超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)公司）；AE24 分析天平（梅特勒-托利多公司）；R-201 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；Multiskan FC 酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HF90 二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器公司）；HHS6 恒溫水?。ㄉ虾＞陮?shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；TL-18M 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械研究所）；Scient2-10N 冷凍干燥機(jī)（上海新芝生物科技股份公司）。

1.2 原料與試劑

1.2.1 試劑 乙腈（HPLC 級(jí)，Adamas 公司）；無水乙醇（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠）；無水甲醇（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；三氟乙酸（TFA，Adamas 公司）；三氯甲烷（分析純，國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司）；衍生化試劑 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，Adamas 公司)。單糖對(duì)照品：甘露糖(Man)、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、巖藻糖（Fuc）、氨基葡萄糖（GlcN）和木糖（Xyl），均購(gòu)于上海源聚生物科技有限公司；葡萄糖(Glc，上海化學(xué)試劑公司)；半乳糖醛酸（GalA，F(xiàn)luka 公司）；葡萄糖醛酸(GlcA，Aladdin 公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司）; 胎牛血清（美國(guó)GIBCO 公司）; 磷酸鹽緩沖液（美國(guó)GIBCO公司）；脂多糖（LPS）（美國(guó)Sigma 公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（美國(guó)Sigma 公司）；一氧化氮檢測(cè)試劑盒E1030（普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2.2 原材料產(chǎn)地 茯苓樣品分別來源于云南、安徽、河北、河南、湖南、四川、福建等7 個(gè)產(chǎn)地，見表1。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株：小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 茯苓多糖的提取

將茯苓烘干、粉碎、過篩后待用。按料液比（原料質(zhì)量與溶劑體積之比，g/mL）1∶10 加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液進(jìn)行脫脂，在85 ℃的水浴鍋中加熱回流4 h。脫脂后濾渣置于烘箱中干燥。稱取50 g濾渣，按料液比1∶10 加入500 mL的雙蒸水，在90 ℃的水浴中提取2 次，提取時(shí)間為2 h，將濾液合并，濃縮至30 mL，然后加入4 倍體積的無水乙醇，混合均勻后放置在4 ℃的冰箱里過夜，使多糖沉淀下來。離心后去除上清液，冷凍干燥后得到茯苓多糖。

表 1 原材料批次與產(chǎn)地Table 1 Sample batches and place of origin

2.2 單糖組成分析

取6 mg 多糖樣品于安瓿瓶中，加入2 mol/L TFA 2 mL，使其充分溶解。封管后在120 ℃的烘箱中水解4 h，冷卻至室溫，加入適量甲醇在40 ℃下減壓旋蒸至干，重復(fù)此操作7～8 次，除去過量的TFA，得到水解產(chǎn)物，用雙蒸水溶解后備用。

配制1 mg/mL 的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液，取水解后的樣品和單糖標(biāo)準(zhǔn)液各0.5 mL，加入0.6 mol/L NaOH溶液0.5 mL，混合均勻后，再加入0.5 mol/L PMP 的甲醇溶液1 mL，置于70 ℃烘箱中反應(yīng)100 min。冷卻至室溫后用鹽酸溶液中和，最后將中和后的溶液用氯仿萃取3 次，棄去氯仿相，水相用0.45 μm 微孔膜過濾后供HPLC 進(jìn)樣分析。

采用Agilent 1260 HPLC 儀進(jìn)行分析，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相為乙腈和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，其體積比為18∶82；檢測(cè)器二級(jí)陣列管檢測(cè)器(DAD)，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

2.3 茯苓多糖指紋圖譜建立

分別取16 批不同產(chǎn)地的茯苓多糖各6 mg，按2.2 節(jié)的方法獲得不同產(chǎn)地茯苓多糖單糖組成的HPLC 譜圖，將色譜數(shù)據(jù)依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A）軟件，得到指紋圖譜。

2.4 多糖完全酸水解產(chǎn)物分析方法的考察

2.4.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將衍生化后的同一樣品放置0、4、8、12、24 h 后，測(cè)定單糖組成及含量，考察該方法的穩(wěn)定性。

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)同一批次樣品取5 份，分別進(jìn)行水解、衍生化、中和萃取等操作，制備得到平行的5 份供試液，測(cè)定單糖組成及含量，考察單糖分析方法的重復(fù)性。

2.4.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn) 取9 個(gè)單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的衍生溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，比較各個(gè)共有峰的保留時(shí)間和峰面積，考察儀器的精密度。

2.5 MTT 法測(cè)試細(xì)胞相對(duì)存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期密度為每毫升104個(gè)的RAW 264.7細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，分成濃度分別為12.5、25、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL共10 個(gè)劑量的茯苓多糖處理組和培養(yǎng)基培養(yǎng)的空白對(duì)照組，每個(gè)組別設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，各孔加液體積為200 μL；置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，每孔加入30 μL MTT (0.5 mg/mL)的磷酸鹽緩沖溶液，相同條件避光孵育4 h 后吸去各孔液體，加入200 μL 二甲基亞砜溶液溶解生成的結(jié)晶物，靜置10 min 后，使用酶標(biāo)儀于492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD 值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

2.6 Griess 法測(cè)定NO 的濃度[13]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW 264.7 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，密度為每毫升105個(gè)細(xì)胞，接種于96 孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，將茯苓多糖用培養(yǎng)基分別稀釋為質(zhì)量濃度50、100、200 μg/mL，每孔加入200 μL，每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，陽性對(duì)照組加入同體積0.1 μg/mL LPS（脂多糖），培養(yǎng)24 h。采用Griess 法測(cè)定NO 濃度：吸取50 μL 培養(yǎng)基，之后加入50 μL Griess I 試劑，靜置后，加入50 μL Griess II試劑。用酶標(biāo)儀測(cè)試492 nm 處的吸光度（OD）。

3 結(jié)果與討論

3.1 茯苓多糖指紋圖譜

16 批不同產(chǎn)地茯苓多糖構(gòu)建的指紋圖譜如圖1所示。不同產(chǎn)地樣品的液相色譜圖相似度較高，有8 個(gè)共有峰。將各批茯苓多糖色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012A），以S1 藥材的HPLC 圖譜作為參照譜，采用mark 峰匹配的方法，選中所有共有峰，建立茯苓多糖的對(duì)照指紋圖譜，見圖2中a。通過和9 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液的衍生化色譜圖（圖2 中b）比對(duì)，確定8 個(gè)共有峰分別為甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖。其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的含量較高，峰面積占比之和超過98%；而氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖和阿拉伯糖的含量很低。各產(chǎn)地茯苓多糖的單糖組成與對(duì)照指紋圖譜相一致，但不同單糖的相對(duì)比例有較小差異。不同產(chǎn)地樣品和對(duì)照指紋圖譜的相似度分析結(jié)果如表2 所示，相似度在0.980～1.000 之間，表明各產(chǎn)地茯苓多糖之間差異較小，可以采用建立的指紋圖譜評(píng)價(jià)茯苓多糖的質(zhì)量。

圖 1 16 批茯苓多糖的指紋圖譜Fig. 1 Fingerprints of 16 groups of PCPs

3.2 分析方法考察結(jié)果

單糖組成及含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品各共有峰峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 小于4.2%，保留時(shí)間的RSD 小于2%，表明檢測(cè)方法在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

圖 2 茯苓多糖完全酸水解產(chǎn)物的對(duì)照指紋圖譜（a）及混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相圖譜（b）Fig. 2 Control fingerprints of complete acid hydrolyzate of PCPs (a) and HPLC of mixed monosaccharide (b)

表 2 16 批茯苓多糖相似度分析結(jié)果Table 2 Results of similarity of 16 groups of PCPs

用HPLC 分析單糖組成及含量，各共有峰峰面積的RSD 值小于6.2%，保留時(shí)間的RSD 值小于0.9%，表明檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

對(duì)9 個(gè)單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的衍生溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，比較各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，各共有峰峰面積的RSD 小于0.12%，保留時(shí)間的RSD 小于1.4%，表明該儀器具有良好的精密度。

3.3 細(xì)胞相對(duì)存活率

采用MTT 法測(cè)定RAW 264.7 細(xì)胞的相對(duì)存活率，若細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)的相對(duì)存活率≥85%，則認(rèn)為該濃度范圍的茯苓多糖沒有細(xì)胞毒性。由圖3 可知，當(dāng)茯苓多糖的質(zhì)量濃度范圍為0～600 μg/mL時(shí)，RAW 264.7 細(xì)胞的相對(duì)存活率在0.87～1.15 之間，該濃度范圍內(nèi)的茯苓多糖對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞無細(xì)胞毒性，且當(dāng)茯苓多糖質(zhì)量濃度為 100～200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞的相對(duì)存活率>1，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞增長(zhǎng)。

圖 3 茯苓多糖不同質(zhì)量濃度時(shí)細(xì)胞的相對(duì)存活率Fig. 3 Relative cell survival rate with the different mass concentration of PCPs

3.4 巨噬細(xì)胞釋放NO 的濃度

NO 是體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，不僅是細(xì)胞間、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子，而且在免疫學(xué)上也具有重要的意義。它作為機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的組成部分之一，起著免疫效應(yīng)分子和免疫調(diào)節(jié)劑的作用。Griess法是測(cè)定NO 濃度最常用的方法，測(cè)試結(jié)果如表3 所示，在茯苓多糖的質(zhì)量濃度范圍為50～200 μg/mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞產(chǎn)生NO 濃度隨茯苓多糖質(zhì)量濃度的增加而增加。圖4 將實(shí)驗(yàn)組、空白組和陽性對(duì)照組細(xì)胞產(chǎn)生的NO 濃度進(jìn)行對(duì)比，可見空白組細(xì)胞產(chǎn)生的NO 濃度最低，為（12.96±0.50）μmol/L，陽性對(duì)照組（LPS）細(xì)胞產(chǎn)生的NO 濃度最高，為（27.86±0.84）μmol/L，質(zhì)量濃度為100 μg/mL 和200 μg/mL 的茯苓多糖與空白組相比均有顯著性（P<0.01），且各實(shí)驗(yàn)組NO 濃度均低于陽性對(duì)照組。對(duì)比不同產(chǎn)地茯苓多糖的免疫活性，可以看出云南、安徽等地的茯苓多糖刺激小鼠巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的NO 濃度相對(duì)較高，免疫活性普遍優(yōu)于其他產(chǎn)地的茯苓多糖。

表 3 16 批茯苓多糖刺激RAW264.7 細(xì)胞釋放的NO 濃度Table 3 NO concentration of RAW264.7 cells from 16 groups of PCPs

3.5 茯苓多糖的單糖組成與免疫活性的相關(guān)性分析

正交偏最小二乘回歸是一種用于相關(guān)性分析的方法，它結(jié)合了典型相關(guān)分析、主成分分析以及多元相關(guān)分析的特點(diǎn)，適用于自變量存在自相關(guān)或樣本數(shù)量較少時(shí)的數(shù)據(jù)分析，可以很好地彌補(bǔ)其他分析方法的不足。以各單糖峰面積（AX1～AX8，其中X1～X8 分別表示甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖）作為自變量，NO 的釋放量（Y）作為因變量，茯苓多糖色譜指紋圖譜及免疫活性的數(shù)據(jù)矩陣見表4，將表4 中數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中采用正交偏最小二乘法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[14]，得到自變量的回歸系數(shù)見圖5，回歸系數(shù)反映了每種單糖與免疫活性之間相關(guān)性的大小，系數(shù)的絕對(duì)值越大，說明相關(guān)性越大，系數(shù)的符號(hào)反映了自變量與因變量是呈正相關(guān)還是負(fù)相關(guān)[15]。擬合出回歸方程為Y=1.59AX1?1.28AX2?0.54AX3+0.41AX4+3.32AX5?0.53AX6+1.89AX7?5.51AX8。由方程可知，各單糖含量與小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 的濃度之間的相關(guān)性大小為：巖藻糖>半乳糖>阿拉伯糖>甘露糖>氨基葡萄糖>葡萄糖醛酸>木糖>葡萄糖。其中，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖與免疫活性呈正相關(guān)，而巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖與之呈負(fù)相關(guān)。圖6 示出了茯苓多糖的VIP （Variable impor tance in projection）值，VIP 值反映了自變量對(duì)因變量貢獻(xiàn)的大小，一般認(rèn)為VIP>1 的自變量對(duì)模型有顯著性的貢獻(xiàn)。在該模型中，葡萄糖、半乳糖和甘露糖的VIP 值均大于1，說明其對(duì)刺激小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO 發(fā)揮重要作用。

圖 5 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)Fig. 5 Normalized regression coefficient diagram

圖 6 茯苓多糖的VIP 值Fig. 6 VIP of PCPs

4 結(jié) 論

（1）茯苓多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖以及少量的氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖組成。通過水解并衍生，將16 批不同產(chǎn)地的茯苓多糖的HPLC 色譜圖建立指紋圖譜。相似度分析結(jié)果表明16 批樣品的相似度很高，均在0.981～1.000 之間。

（2）進(jìn)行免疫活性的測(cè)定，各實(shí)驗(yàn)組NO 釋放濃度均高于空白對(duì)照組，且NO 的釋放濃度隨著茯苓多糖濃度的增大而增大。

（3）通過正交偏最小二乘法擬合出回歸方程，根據(jù)自變量的回歸系數(shù)可判斷出半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖與小鼠巨噬細(xì)胞的免疫活性呈正相關(guān)；巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖與免疫活性呈負(fù)相關(guān)，其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖對(duì)免疫活性具有顯著貢獻(xiàn)。

（4）本文初步研究了茯苓多糖指紋圖譜與小鼠巨噬細(xì)胞NO 的釋放量之間的關(guān)系，為科學(xué)地制定茯苓多糖的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。