孫傳伯，曹 猛，陳存武，趙 群

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237000；2.海南大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南 ?？?570228)

拉格啤酒(Lager Beer，名字來源于德語：Lagern，意為窖藏)，又稱窖藏啤酒，是一種利用低溫熟成技術(shù)制作的啤酒。采用桶底發(fā)酵的酵母菌發(fā)酵而成。在現(xiàn)在的市場上，啤酒的品牌多，市場需求量大，各種品牌都有其特色作為賣點(diǎn)，然而很多啤酒在其風(fēng)味物質(zhì)控制方面做得不夠。不管是哪一種啤酒，因其原料所含有的營養(yǎng)物質(zhì)很豐富，在發(fā)酵過程中被微生物分解，生成很多產(chǎn)物，其中有多種風(fēng)味物質(zhì)，比如醛類、高級醇、高級酯等，它們對啤酒的風(fēng)味影響差別也很大，尤其是乙醛造成的影響較大。除此外，根據(jù)一些研究報(bào)道指出乙醛對人體有一定的危害，產(chǎn)生不良反應(yīng)，包括使人產(chǎn)生惡心、嘔吐等[1]。如果我們能夠?qū)⑵【浦幸胰┑暮靠刂葡聛?，對其的風(fēng)味和其對人健康的影響的變化都是很大的。從目前發(fā)表的文章等可以發(fā)現(xiàn)，通過改進(jìn)生產(chǎn)工藝的方法來降低產(chǎn)生的乙醛含量的方法很多[2]，也有人利用分子生物學(xué)的技術(shù)處理菌株[3]，此外，還有利用超高壓進(jìn)行誘變的方法等[4-5]。本實(shí)驗(yàn)是在紫外誘變技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過一系列篩選方法確定一種篩選產(chǎn)乙醛低的酵母的方法，以便用于拉格的工業(yè)化生產(chǎn)中，做到以此方法篩選的菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)獲得高品質(zhì)拉格啤酒，同時(shí)，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)方面的效益。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備

見表1。

1.2 材料和試劑

見表2。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麥芽汁培養(yǎng)基的制備

用粉碎機(jī)將麥芽粉碎，稱取粉碎物，以1∶4(麥芽:水)的比例加入足量的水，在65 ℃水浴鍋中加熱2 h，取出進(jìn)行首次過濾后，對濾液煮沸15 min后，進(jìn)行再次過濾，用糖度計(jì)測其糖度，并加水調(diào)整糖度值為10后，進(jìn)行滅菌(121 ℃，20 min)，對滅菌后的培養(yǎng)基進(jìn)行再一次的過濾滅菌。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用儀器設(shè)備

表2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.3.2 酵母的活化

向200mL無菌水中加入無菌條件下取的斜面試管酵母(編號L33)，置于搖床上進(jìn)行活化處理。吸取少量活化后的酵母懸液進(jìn)行平板涂布，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(28 ℃，48～72 h)。選擇培養(yǎng)后長勢較好的單菌落作為出發(fā)菌株1，進(jìn)行斜面保藏。

1.3.3 篩選方法

方法一(希夫組)：在麥芽汁平板上涂布出發(fā)菌株1，紫外誘變后，經(jīng)新配制的希夫試劑篩選后進(jìn)行高效液相色譜分析；

方法二(甲吡唑組)：在添加有甲吡唑的麥芽汁培養(yǎng)基上涂布出發(fā)菌株1，紫外誘變后，經(jīng)新配制的希夫試劑篩選后進(jìn)行高效液相色譜分析；

方法三(乙醛組)：在麥芽汁培養(yǎng)基上涂布出發(fā)菌株1，紫外誘變后，先經(jīng)希夫試劑篩選后，再在添加有乙醛的培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布篩選，最后再通過高效液相色譜進(jìn)行分析。

1.3.4 紫外誘變條件的優(yōu)化

超凈工作臺(tái)的紫外燈的功率為20 W，實(shí)驗(yàn)中以菌株與紫外燈的距離以及菌株被紫外燈照射的時(shí)間為變量。其中距離分別為18 cm、24 cm、30 cm，照射時(shí)間分別為0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s，共21組，每組三個(gè)平行[6]。把涂布有酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基平板置于上述條件下進(jìn)行紫外誘變處理。選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)關(guān)于紫外誘變處理的最優(yōu)條件。

1.3.5 希夫試劑的配方優(yōu)化

方法一：詳細(xì)方法詳見參考文獻(xiàn)[7]，文獻(xiàn)方法中的蒸餾水替換為去離子水。

方法二：詳細(xì)方法詳見參考文獻(xiàn)[8]。

1.3.6 甲吡唑培養(yǎng)基濃度的優(yōu)化

配制甲吡唑溶液并密封保存于4 ℃條件下。將1 g/L濃度的甲吡唑溶液用無菌注射器在0.2 μm無菌膜下過濾。分別吸取一定量配制成甲吡唑濃度為0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、650 mg/L、700 mg/L、750 mg/L、800 mg/L、850 mg/L、900 mg/L，每組平板做三個(gè)平行。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中甲吡唑培養(yǎng)基中甲吡唑的最佳濃度[8]。

1.3.7 乙醛培養(yǎng)基濃度的優(yōu)化

從經(jīng)過紫外誘變后篩選得到的酵母菌種中選擇任意的一種，用于做乙醛培養(yǎng)基中乙醛濃度的優(yōu)化。取適量經(jīng)過稀釋后的乙醛加入培養(yǎng)基中，從而使得乙醛的終濃度分別為0 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L、3 mg/L、3.5 mg/L、4 mg/L、4.5 mg/L、5 mg/L。每組做三個(gè)平行平板，根據(jù)平板上酵母菌的存活率來確定出乙醛培養(yǎng)基中乙醛的最佳濃度[9]。

1.3.8 三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

對所有篩選出的斜面保藏的菌株進(jìn)行三角瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：從裝有100 mL無菌水的三角瓶中取少量水加入到試管斜面，用接種環(huán)將斜面上的菌刮下來后，然后將其加入到前面裝有無菌水的三角瓶中，然后進(jìn)行適度稀釋，再向裝有100 mL麥芽汁的三角瓶中分別加入1 mL菌液(107個(gè)/ML)，每支試管樣至少做3～5個(gè)三角瓶，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.9 液相色譜條件的優(yōu)化

流動(dòng)相中乙腈與水體積比為3∶1，柱溫為30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，將其分析運(yùn)行時(shí)間分別設(shè)置為5 min、10 min，流速分別設(shè)置為0.1 mL/min、0.2 mL/min、1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10.0 μL，檢測波長360 nm[10]，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行液相條件的優(yōu)化[11]。

精確取2,4-二硝基苯肼0.0500 g，用乙腈進(jìn)行定容配制成濃度為50 mg/L的溶液，并經(jīng)過孔徑0.45 μm的有機(jī)系微孔濾膜過濾處理。同時(shí)將接種酵母后的得到的發(fā)酵液經(jīng)過孔徑為0.45 μm的水系微孔濾膜過濾處理。按照體積比分別為1∶1、1∶2、1∶5、2∶1、5∶1取發(fā)酵液與2,4-二硝基苯肼溶液進(jìn)行混合，靜止30 min后進(jìn)行測定[12]。

1.3.10 液相色譜測發(fā)酵液中的乙醛含量

因?yàn)橐胰┡c2,4-二硝基苯肼兩種物質(zhì)混合后會(huì)反應(yīng)產(chǎn)生乙醛-2,4-二硝基苯腙，利用液相色譜，通過外標(biāo)法測定反應(yīng)產(chǎn)物的含量再通過反應(yīng)關(guān)系換算求得乙醛含量。稱取0.0052 g乙醛-2,4-二硝基苯腙的標(biāo)準(zhǔn)品，并用乙腈定容至50 mL，分別從中取0 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL定容至50 mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)待測溶液，按照液相色譜的優(yōu)化條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。以配制的標(biāo)準(zhǔn)品乙醛-2,4-二硝基苯腙的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，制作關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便后續(xù)定量分析的需要[13-16]。

發(fā)酵液乙醛含量測定：取前面提到的經(jīng)過處理的發(fā)酵液用于液相色譜測定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，由峰面積計(jì)算出樣品中反應(yīng)產(chǎn)物乙醛-2,4-二硝基苯腙的濃度，從而計(jì)算出發(fā)酵液中乙醛含量。根據(jù)所有發(fā)酵液測出來的值，經(jīng)過換算后得出各菌株發(fā)酵液中乙醛含量。對各組發(fā)酵液進(jìn)行乙醛降幅和平均降幅的計(jì)算[9]。

1.3.11 方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

重新選取一株酵母菌作為出發(fā)菌株2(編號L37)，通過前面選出的最優(yōu)方法對其進(jìn)行處理后篩選的菌株作為原代，同時(shí)進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，連續(xù)培養(yǎng)至第5代，對每代菌都進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，按照同樣的液相色譜條件進(jìn)行測量分析[17]，驗(yàn)證篩選方法的穩(wěn)定性。對出發(fā)菌株2及經(jīng)過篩選方法后得到的出發(fā)菌株2原代進(jìn)行鏡鑒比較，觀察其的形態(tài)差別。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變最優(yōu)條件

圖1 希夫試劑配方比較(左為方法一，右為方法二)

從表3中可以看出，隨著照射時(shí)間以及光源距離的縮短，菌株的存活率逐漸降低，相對于照射距離，照射時(shí)間對酵母菌的存活率影響更大，尤其是在照射30 s～45 s的范圍，酵母的存活率大大降低，基本是由70%降到20%。當(dāng)照射時(shí)間為90 s時(shí)，存活率就變得很低?？紤]到實(shí)驗(yàn)需要選擇一定量的菌株，所以本實(shí)驗(yàn)采用菌株存活率在20%左右的篩選條件，因此紫外誘變的最優(yōu)條件是45 s，24 cm。

表3 紫外誘變條件的優(yōu)化結(jié)果

2.2 希夫試劑配方的優(yōu)化

按照希夫試劑的兩種方法進(jìn)行配制，對菌株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)使用方法一配制的希夫試劑染色效果較好，且不會(huì)造成菌落被沖散的現(xiàn)象，不同菌落顏色變化差別明顯；使用方法二配制的希夫試劑染色過淺，不同菌落染色出現(xiàn)的差別不明顯，同時(shí)菌落很容易就被沖散，出現(xiàn)呈類似于固體被溶解的現(xiàn)象。

2.3 甲吡唑培養(yǎng)基中甲吡唑濃度的優(yōu)化

表4 甲吡唑濃度的優(yōu)化

在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過程中，起初配制的培養(yǎng)基中含有的甲吡唑濃度在0～600 mg/L范圍內(nèi)，但是由于菌株死亡率不高(未進(jìn)行詳細(xì)的記錄)，所以將其濃度繼續(xù)增大。本實(shí)驗(yàn)的思路是，將菌株涂布在含有甲吡唑的培養(yǎng)基不進(jìn)行誘變，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定菌株存活率為0時(shí)的甲吡唑濃度，再將菌株涂布在此濃度的甲吡唑培養(yǎng)基上并進(jìn)行紫外誘變，此時(shí)平板上長出的菌即為突變后的菌株，再用希夫試劑進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。而從表5中可以看到，當(dāng)甲吡唑培養(yǎng)基中的甲吡唑濃度為900 mg/L時(shí)，酵母菌的存活率為0，所以最優(yōu)的甲吡唑濃度為900 mg/L。

2.4 乙醛培養(yǎng)基中乙醛濃度的優(yōu)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件測得的酵母菌的存活率如表5。

表5 乙醛濃度的優(yōu)化

由表5中的數(shù)據(jù)可以看出，隨著培養(yǎng)基中乙醛含量的升高，酵母菌的存活率越來越低，總的來看，存活率降低的速度比較穩(wěn)定。因?yàn)榇谁h(huán)節(jié)是在紫外誘變后并且已經(jīng)被希夫試劑篩選過的菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，而后面將菌株涂布在含有乙醛的培養(yǎng)基上需要有一定的存活率才能保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，所以此環(huán)節(jié)考慮采用菌株存活率為20%左右的篩選條件，由表6知，所選取的乙醛培養(yǎng)基中乙醛的最佳濃度為5.5 mg/L。

2.5 液相色譜測發(fā)酵液中的乙醛含量

高效液相色譜測定中，流動(dòng)相中乙腈與水的體積比為3∶1，流速為1.0 mL/min，對所進(jìn)樣品的分析運(yùn)行時(shí)間為5 min，每次所進(jìn)樣的量為10.0 μL，柱溫為30 ℃，檢測器為二極管陣列檢測器，檢測波長為360 nm。

將經(jīng)過孔徑為0.45 μm的水系微孔濾膜過濾的發(fā)酵液，與經(jīng)過孔徑為0.45 μm的有機(jī)系微孔濾膜過濾的2,4-二硝基苯肼，按照體積比為2∶1的比例加入反應(yīng)管，靜置30 min后再進(jìn)行測定的前處理方法相對較好。

根據(jù)前面得到的優(yōu)化后的液相色譜的優(yōu)化條件分析標(biāo)準(zhǔn)品，所得譜圖如下圖2：

圖2 樣品發(fā)酵液液相色譜圖

由配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液測得的值如下表6：

表6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定

由表6中數(shù)據(jù)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，以其峰面積為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：y=60.361x-1.3722，R2為0.9999，由此可以看出線性相關(guān)程度較好。

根據(jù)最優(yōu)液相色譜條件測得的發(fā)酵液中乙醛濃度如表7、表8和表9所示。

表7 發(fā)酵液中乙醛濃度的測定(希夫組)

表8 發(fā)酵液中乙醛濃度的測定(甲吡唑組)

表9 發(fā)酵液中乙醛濃度的測定(乙醛組)

由表7、表8和表9中的數(shù)據(jù)計(jì)算可得，方法一的正突變菌株在所在希夫組占比為54.55%，平均降幅為17.49%，方法二的正突變菌株在所在甲吡唑組占比為25%，平均降幅為18.10%，方法三的正突變菌株在所在乙醛組占比為72.73%，平均降幅為26.12%。從突變方向來看，方法三的正突變率最高，而方法二的正突變率最低，此組內(nèi)大部分都為負(fù)突變菌株且其的乙醛增幅較大。從乙醛降幅上來看，方法一的平均降幅最小，而同樣是方法三的平均降幅最大。綜合這兩點(diǎn)，方法三的效果最好，此法能夠在高的正突變率的前提下，獲得產(chǎn)乙醛低的菌株。

2.6 方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

表10 方法穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

圖3 出發(fā)菌株2(左)及原代(右)鏡檢圖

為保證穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可對比性，除了測定從出發(fā)菌株2原代到第5代的菌株發(fā)酵液外，同時(shí)測定出發(fā)菌株2的發(fā)酵液，從表10中可以發(fā)現(xiàn)，各代菌株產(chǎn)生的乙醛含量都低于原菌發(fā)酵液中的乙醛量，相對于出發(fā)菌2，出發(fā)菌株2原代至第5代產(chǎn)生的乙醛降幅為9.32%、8.56%、7.16%、7.92%、7.22%、6.46%，雖然隨著代數(shù)的增加產(chǎn)生的乙醛含量呈現(xiàn)出較小的增加的現(xiàn)象，但是乙醛降幅基本保持在7%左右，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，方法三的這種篩選方法具有一定的穩(wěn)定性。對出發(fā)菌株2和經(jīng)方法三篩選后的原代進(jìn)行鏡鑒，未見其有任何明顯的形態(tài)差異，由此也可初步認(rèn)為方法三對菌株的影響表現(xiàn)在菌株內(nèi)部或者代謝調(diào)節(jié)等其他方面。

出發(fā)菌株2及經(jīng)篩選后的原代鏡檢的結(jié)果如圖3所示，出發(fā)菌株2原代的平板如圖4所示。

圖4 出發(fā)菌株2原代平板

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)

3.1.1 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中的出發(fā)菌株1和2的發(fā)酵液中乙醛的含量均小于2.0 mg/L，達(dá)到優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量要求(≤8.0 mg/L)。本實(shí)驗(yàn)通過三種方法進(jìn)行菌株的篩選，每種方法都有一定的篩選效果。其中方法三降低菌株產(chǎn)乙醛的量的效果最好，出發(fā)菌株1的正突變率達(dá)到72.73%，乙醛平均降幅達(dá)到26.12%，且此方法具有一定的穩(wěn)定性，可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中。

3.1.2 創(chuàng)新點(diǎn)

1)實(shí)驗(yàn)中方法三將紫外誘變、希夫試劑初篩與乙醛培養(yǎng)基二次篩選和高效液相色譜定量測定綜合起來，對出發(fā)菌株進(jìn)行多次的連續(xù)篩選，能夠進(jìn)一步降低菌株產(chǎn)生乙醛的量，此法在目前的研究中還未見有報(bào)道。

2)本實(shí)驗(yàn)中使用的出發(fā)菌株是從啤酒生產(chǎn)工廠獲得，是對生產(chǎn)菌株的優(yōu)化，是進(jìn)一步的改進(jìn)。目前的研究中，大都是對實(shí)驗(yàn)室保存的而未投入生產(chǎn)中的菌株的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)中的菌株，其發(fā)酵液中乙醛含量降低幅度雖然不大，但是實(shí)驗(yàn)是在出發(fā)菌株的發(fā)酵液本身乙醛含量(<2.0 mg/L)就比較低的基礎(chǔ)上，再進(jìn)一步降低其含量的，而其他研究中所用到的出發(fā)菌發(fā)酵液中的乙醛含量比較高(3.0～10.0 mg/L)。由此也能看出，實(shí)驗(yàn)中方法三的篩選效果好。由產(chǎn)乙醛量降低這點(diǎn)也可以考慮適當(dāng)調(diào)整企業(yè)工廠的啤酒發(fā)酵時(shí)間，在原有的基礎(chǔ)上進(jìn)一步縮短，從而降低能源的消耗，增加企業(yè)的收益。

3.2 討論

本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行液相色譜測定前的樣品前處理時(shí)，沒有對乙醛與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)可以對反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，找到最佳的反應(yīng)時(shí)間長度。同時(shí)接下來可以對接種菌株的三角瓶的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化[18]，在保證啤酒品質(zhì)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步為企業(yè)生產(chǎn)增加收益。實(shí)驗(yàn)中雖然從三種方法中篩選出一株產(chǎn)乙醛量最低的菌株并進(jìn)行了斜面保存，但是由于時(shí)間的因素，沒有對其進(jìn)行進(jìn)一步的菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，下一步可以考慮對其進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)是利用高效液相色譜儀進(jìn)行樣品的定量分析測定的方法，它相對于一般的方法具有高效靈敏的優(yōu)點(diǎn)。然而相對氣質(zhì)聯(lián)用分析來講，氣質(zhì)聯(lián)用既體現(xiàn)了色譜法的高分離能力，又體現(xiàn)了質(zhì)譜法的高鑒別能力，比高效液相色譜更適合乙醛含量的測定分析。本實(shí)驗(yàn)起初考慮使用氣質(zhì)聯(lián)用儀，但是由于儀器處于被占用狀態(tài)以及考慮到時(shí)間因素，沒能順利進(jìn)行，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)可以考慮通過氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析。