杜 宇,張皓冰,楊宇琪,汪 妍,趙紅燕,林熾賢

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 a.水產(chǎn)與生命學(xué)院;b.海南省兩棲爬行動物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 三亞 572022;2.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,杭州 311121)

0 引言

單鏈抗體又稱單鏈抗體可變區(qū)片段(Single-chain antibody variable fragment,ScFv)，是一類極具潛力的基因工程抗體，分子量小、特異性強(qiáng)及異源性低的特點(diǎn)使其能精準(zhǔn)地與抗原結(jié)合，與傳統(tǒng)方法制備的抗體相比，還能有效降低對機(jī)體的過敏反應(yīng)[1-2].目前，制備單鏈抗體的方法多為將單鏈抗體基因通過體外重組插入載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中大量擴(kuò)增和表達(dá)，大大增加基因的拷貝，使得篩選優(yōu)良單鏈抗體基因更加簡便[3-6].單鏈抗體研制已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，相關(guān)技術(shù)也已十分成熟.其中，噬菌體展示技術(shù)可以將表型和基因型有機(jī)地聯(lián)系在一起，不經(jīng)人體免疫和雜交瘤技術(shù)便可實(shí)現(xiàn)體外篩選富集，可直接制備人源化基因工程抗體，也可通過改造實(shí)現(xiàn)非人源化抗體基因的人源化，是當(dāng)前被廣泛研究和運(yùn)用的單鏈抗體研制技術(shù)[7-9].

本研究以平頦海蛇(Hydrophiscurtus)蛇毒免疫小鼠，通過誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答以獲取脾臟總RNA并構(gòu)建cDNA文庫，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體重鏈(VH)可變區(qū)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因片段并拼接成ScFv基因，重組至噬菌體并轉(zhuǎn)化TG1敏感菌，用輔助噬菌體侵染建立蛇毒蛋白抗體ScFv噬菌體文庫，最終從文庫中初步篩選獲得陽性克隆.該研究的成功可為繼續(xù)制備性能穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、親和力高和效能多樣的鼠源性單鏈小分子抗體及其人源化改造提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 蛇毒與試劑

本實(shí)驗(yàn)用的平頦海蛇毒凍干粉為本實(shí)驗(yàn)室自有制品.弗氏完全佐劑和不完全佐劑購自Sigma公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq酶購自Abm公司；核酸提取試劑盒、質(zhì)粒制備試劑盒、PCR清潔試劑盒、Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶、載體和T4連接酶購自TakaRa公司；TG1菌株和M13K07輔助噬菌體購自GE公司；氨芐、卡那霉素、感受態(tài)細(xì)胞、LB培養(yǎng)基粉及其他分析純試劑均購自上海生工.所有引物合成及測序皆由上海生工完成.

1.2 小鼠免疫

選擇2只10周齡Balb/c小鼠用于蛇毒免疫.稱取足量可供整個免疫過程所需的平頦海蛇毒凍干粉，用生理鹽水配制成10 g·L-1母液，用0.22 μm針式濾頭過濾，隨后保存于-20 ℃冰箱中備用.按照0.02 μg·g-1的蛇毒劑量對小鼠進(jìn)行首程免疫，免疫前吸取足量母液至1.5 mL離心管，于90 ℃水浴30 min滅活，后加入等體積的弗氏完全佐劑，乳化徹底后按每只300 μL的劑量腹腔注射小鼠.第2～3周按照0.05 μg·g-1和0.1 μg·g-1的劑量分別進(jìn)行2次加強(qiáng)免疫，滅活后蛇毒用弗氏不完全佐劑乳化，注射方式同首程免疫.

1.3 小鼠脾臟總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄

第2次加強(qiáng)免疫7 d后，摘取小鼠新鮮脾臟，于液氮預(yù)冷的研缽中快速研磨至粉末狀，按照核酸提取試劑盒操作方法提取脾臟總RNA.檢測總RNA的純度及濃度達(dá)到要求后，按照5×All-In-One RT MasterMix 試劑盒說明書去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA第1鏈.

1.4 單鏈抗體基因構(gòu)建

以cDNA為模板，分別擴(kuò)增重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)片段[8-9].所用引物為：重鏈上游引物TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC，重鏈下游引物AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG；輕鏈上游引物CCGTTTGAT-TTCCAGCTTGGTGCC，輕鏈下游引物GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA；linker引物GGGACCACGGTCACCGTCTCCTCACTCGAGTGG與TGGAGACTGG-GTGAGCTCAATGTCCTGTGCACT；帶內(nèi)切酶位點(diǎn)全長ScFv基因的上游引物GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC，下游引物GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG.反應(yīng)體系為：DNA模板0.8 μL，引物各0.4 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去離子水補(bǔ)至20 μL.反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火55 s，72 ℃延伸70 s，共30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min.用 1%瓊脂糖凝膠檢測擴(kuò)增產(chǎn)物.純化 PCR 產(chǎn)物連接 PMD-19T 載體，連接體系為10 μL，連接好的克隆載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，涂布到氨芐青霉素濃度100 mg·L-1的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落搖菌擴(kuò)增.以測序成功的VH和VL質(zhì)粒與相匹配的linkerDNA 三者互為模板.采用重疊延伸拼接 PCR(SOE-PCR)重組為單鏈抗體片段(ScFv)，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒各0.8 μL，linkerDNA 1.6 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去離子水加至20 μL.反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火55 s，共7次循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，將VH和VL拼接為ScFv.

在ScFv基因的5'和3'端分別引入Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)，設(shè)置反應(yīng)體系為：RS引物混合物0.4 μL，2×PCRTaqMasterMix 10 μL，去離子水加至20 μL.反應(yīng)條件為：94 ℃變性1 min，55 ℃退火2 min，72 ℃延伸10 min，25次循環(huán)后，再72 ℃延伸10 min.得到單鏈抗體片段后，連接轉(zhuǎn)化至DH5α，涂布平板，培養(yǎng)過夜.挑取陽性菌落經(jīng)質(zhì)粒抽提后送檢測序.

1.5 單鏈抗體基因重組與轉(zhuǎn)化

用限制性內(nèi)切酶Sfi Ⅰ和Not Ⅰ對測序成功的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切消化，反應(yīng)體系：質(zhì)粒1 μg，10×QuickCut Buffer 5 μL，Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶各1μL，加水補(bǔ)足至50 mL.吹吸混勻后于37 ℃水浴孵育30 min，再轉(zhuǎn)移至50 ℃孵育30 min.產(chǎn)物經(jīng)純化后與同樣酶切后的載體pCANTAB-5E以摩爾比3︰1進(jìn)行連接，反應(yīng)體系：10×連接緩沖液2 μL，pCANTAB-5E 50 ng，T4 DNA連接酶1 μL，用滅菌水補(bǔ)足至20吹吸混勻后置于16 ℃連接過夜.

取20 μL上述重組產(chǎn)物與40 μL TG1敏感菌混勻，冰上放置45 min，42 ℃ 2 min，再迅速轉(zhuǎn)移至冰上放置2 min；后加入190 μL 2×YT培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)1 h.隨后鋪SOBAG板，30 ℃過夜，以未轉(zhuǎn)化的TG1為對照.

1.6 單鏈抗體庫擴(kuò)增與篩選

用2×YT培養(yǎng)液洗SOBAG板上的轉(zhuǎn)化克隆，并在37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4后加入M13K07輔助噬菌體，37 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)1 h.隨后，培養(yǎng)液離心(4 000 r·min-1， 4 ℃，10 min)后去上清，用2×YT-AK(含100 mg·L-1氨芐青霉素和50 mg·L-1卡那霉素)培養(yǎng)液重懸沉淀后于37 ℃搖床培養(yǎng)過夜.培養(yǎng)液在4 ℃條件下10 000 g離心10 min，取上清，加入1/5體積的PEG/NaCl(20%聚乙二醇6000，2.5 mol·L-1氯化鈉)，在冰上放置1 h，隨后在4 ℃條件下10 000 g離心10 min ,2次沉淀噬菌體，最后用5 mL PBS溶液重懸沉淀.

將含10 mg·L-1平頦海蛇毒粗毒的0.1mol pH 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉溶液加至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，4 ℃過夜包被.經(jīng)10 mmol pH 7.4 PBS清洗3次后，加入含10%脫脂奶粉的10 mmol pH 7.4 PBS，于37 ℃封閉1 h.經(jīng)PBS清洗后，加入20 mL噬菌體展示單鏈抗體文庫，37 ℃孵育2 h.隨后，用PBST洗滌15次，再用PBS洗滌10次以去除非特異性結(jié)合的噬菌體.加入10 mL處于對數(shù)期的TG1菌液，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h.將產(chǎn)物轉(zhuǎn)入離心管中，加入M13K07輔助噬菌體、氨芐和2%葡萄糖，37 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)1 h.4 000 r·min-1離心10 min，重懸沉淀于2×YT-AK，37 ℃過夜.之后的各輪富集時均加入10 mL噬菌體展示單鏈抗體文庫.

1.7 單鏈抗體噬菌體ELISA檢測

經(jīng)過5輪吸附—洗脫—富集篩選后，對篩選所得的單鏈抗體噬菌體進(jìn)行ELISA檢測.用質(zhì)量濃度為10 mg·L-1的平頦海蛇毒包被96孔板，每孔100 μL，4 ℃過夜.PBST清洗3次后，用含2%脫脂奶粉的PBST溶液于37 ℃封閉1 h.經(jīng)PBST清洗3次后，加入篩選所得產(chǎn)物，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.再用PBST清洗3次，隨后加入鼠抗M13抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.用PBST清洗后，加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠抗體，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h.最后用PBST清洗5次，加入TMB底物液，反應(yīng)20 min后用2.5 mol·L-1硫酸終止反應(yīng).用SpectroMax 384酶標(biāo)儀讀取450 nm下的吸光值.

2 結(jié)果與分析

2.1 單鏈抗體基因的構(gòu)建

用 1%瓊脂糖電泳檢測小鼠IgG輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)和單鏈抗體片段的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示，輕鏈和重鏈可變區(qū)片段分子質(zhì)量分別約為320和360 bp(圖1)，單鏈抗體片段約為750 bp(圖2)，與NCBI數(shù)據(jù)庫公開的鼠源IgG輕鏈、重鏈和單鏈抗體片段長度相符.3種片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫公開數(shù)據(jù)比對結(jié)果顯示，輕鏈和重鏈可變區(qū)片段分別與小家鼠IgG輕鏈、重鏈可變區(qū)片段高度相似，相似度均大于95%(圖3)，表明目的片段擴(kuò)增并連接成功.

*為相同堿基.圖3 ScFv片段序列相似性比對結(jié)果注：H2為ScFv片段中的重鏈可變區(qū)片段；L2為ScFv片段中的輕鏈可變區(qū)片段；K2為小家鼠IgG重鏈可變區(qū)片段-NCBI登錄號KF208249；A2為小家鼠IgG輕鏈可變區(qū)片段-NCBI登錄號AY374128.

2.2 單鏈抗體基因重組噬菌體轉(zhuǎn)化

將攜帶有單鏈抗體基因的重組噬菌體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，倒SOBAG平板，經(jīng)30 ℃過夜培養(yǎng)后，有明顯克隆長出；對照組為未經(jīng)轉(zhuǎn)化的TG1菌，在30 ℃過夜培養(yǎng)后，無克隆長出，結(jié)果表明重組噬菌體轉(zhuǎn)化成功(圖4).

圖4 重組噬菌體轉(zhuǎn)化TG1效果注：左圖為重組噬菌體陽性克隆組；右圖為對照組.

2.3 單鏈抗體噬菌體陽性克隆篩選

經(jīng)過5輪吸附——洗脫——富集篩選后，以平頦海蛇毒蛋白為包被抗原，用篩選所得的單鏈抗體噬菌體進(jìn)行ELISA檢測免疫效價.結(jié)果顯示，2個陽性組(P1和P2)的OD平均值分別為0.15和0.17，對照組(C)的OD平均值為0.10(圖5).陽性組的信號強(qiáng)度微弱.

圖5 陽性和陰性克隆OD值的比較注：C為陰性克??；P1、P2為陽性克隆.

3 討論

與傳統(tǒng)抗體制備技術(shù)相比，基因工程抗體制備技術(shù)能有效改造并獲得抗體功能作用片段，經(jīng)過精簡后的抗體分子將發(fā)揮更為專一的作用，并提高單位劑量抗體制劑的效價[10]2.同時，由于去除了非功能結(jié)構(gòu)，也將有效降低抗體過敏反應(yīng)[11-13].抗蛇毒血清是當(dāng)前治療毒蛇咬傷的最佳藥物，全球每年的蛇傷危害較為嚴(yán)重.由于傳統(tǒng)方法制備抗蛇毒血清周期長、成本高、保存期短以及相較于其他藥物的需求較小等一系列問題，導(dǎo)致生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)積極性不高，常常出現(xiàn)供需失衡[14-16].平頦海蛇為眼鏡蛇科海蛇屬毒蛇，其毒液是多種酶和多肽的混合物，毒性強(qiáng)烈，是我國海域中常見的有毒爬行動物，對海上作業(yè)及近海旅游等造成了一定的危害.國內(nèi)至今仍缺少治療該種毒蛇咬傷的抗體類藥物，利用基因工程技術(shù)改造并制備平頦海蛇毒單鏈抗體有望為制備新型小分子抗海蛇毒藥物提供參考.

1990年,Mccafferty等[17]最早通過 PCR 擴(kuò)增機(jī)體抗體可變區(qū)基因并重組表達(dá)于噬菌體表面，構(gòu)建噬菌體抗體庫.利用噬菌體展示技術(shù)制備單鏈抗體，已成為當(dāng)前抗體研制的熱點(diǎn)之一[10]1.該技術(shù)是一種高效基因表達(dá)篩選技術(shù)，將外源蛋白或多肽與特定的噬菌體衣殼蛋白融合，展示在噬菌體表面并保持相對獨(dú)立的空間構(gòu)象和生物活性，有利于靶分子的特異性識別及結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)基因型和表現(xiàn)型的統(tǒng)一.有別于傳統(tǒng)的單克隆抗體技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)可對各種抗原進(jìn)行高通量篩選，快速獲得抗體片段，從而迅速得到廣泛應(yīng)用.將單鏈抗體連接pCANTAB-5E載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增，建立單鏈抗體庫.抗體庫的庫容量和多樣性是決定抗體庫質(zhì)量的兩個重要的指標(biāo).庫容量越大，從中獲得高親和力抗體的可能性就越大；多樣性好，從中篩選到不同目的抗體的概率就大.

本研究用平頦海蛇毒腹腔注射小鼠進(jìn)行周期性免疫，以誘導(dǎo)小鼠免疫系統(tǒng)對海蛇毒產(chǎn)生應(yīng)答，獲取可編碼識別該種蛇毒組分的小鼠免疫球蛋白mRNA.制備單鏈抗體基因時，使用RT-PCR技術(shù)結(jié)合SOE-PCR技術(shù)，以cDNA為模板擴(kuò)增抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)片段并以linker相連，此方法可以免去限制性內(nèi)切酶消化，連接酶的處理等環(huán)節(jié)，只需在設(shè)計引物時引入重疊區(qū)域就可以實(shí)現(xiàn)目的片段之間的有效拼接[18-19].利用特定引物擴(kuò)增的輕鏈和重鏈可變區(qū)片段及單鏈抗體基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證無非特異性條帶出現(xiàn)，經(jīng)純化后去除引物二聚體便可得到較為純凈的目的基因，測序結(jié)果也進(jìn)一步證明了所得基因片段的準(zhǔn)確性，可用于后續(xù)表達(dá)載體的構(gòu)建.

盡管本研究已構(gòu)建了相應(yīng)的單鏈抗體庫，但在用ELISA檢測由平頦海蛇毒篩選過的噬菌體文庫時，并未達(dá)到理想效果.五輪篩選的陽性克隆吸光值較低，無法呈現(xiàn)強(qiáng)陽性檢測效果，可能在篩選過程中，存在較多的非特異性的融合噬菌體，還可能是由于噬菌體濃度過低.因此，在對單鏈抗體噬菌體文庫篩選過程仍然需要進(jìn)一步改善和優(yōu)化.應(yīng)在篩選過程中，通過進(jìn)一步構(gòu)建次級庫，改進(jìn)洗脫條件，增加篩選模式等措施以使陽性重組噬菌體得到有效富集.本研究嘗試了利用基因工程技術(shù)構(gòu)建平頦海蛇毒單鏈抗體并建立了單鏈抗體噬菌體展示文庫，初步嘗試篩選單鏈抗體，總結(jié)了一套切實(shí)可行的實(shí)驗(yàn)方案，后期應(yīng)進(jìn)一步提高陽性富集效果.