于振豪,呂嵐清,劉文侃,黃 馨,李玉潔,卓文琪,陳 燕,馬 軍,黃 海

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 a.熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點實驗室;b.海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護(hù)與利用重點實驗室;c.水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南 三亞 572022;2.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院,浙江 寧波 315823)

0 引言

發(fā)光細(xì)菌是一類在正常生理條件下能產(chǎn)生熒光素酶并利用其發(fā)射可見熒光的細(xì)菌.目前，已知的發(fā)光細(xì)菌主要涉及弧菌屬(Vibrio)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)和光桿菌屬(Photorhabdus)[1]，其中，明亮發(fā)光桿菌(P.Phosphoreum)、費氏弧菌(V.fischeri)和青?；【?V.qinghaiensis)等被廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒性檢測[2-4].這些發(fā)光細(xì)菌都是在氧氣的作用下，由細(xì)菌熒光素酶催化長鏈脂肪醛(RCHO)和還原型黃素單核苷酸(FMNH2)的氧化還原反應(yīng)，釋放出波長450～490 nm的可見熒光.發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性一直是人們比較關(guān)注的問題，各國研究人員對此進(jìn)行了不少研究，如發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光機(jī)制，發(fā)光基因Lux系統(tǒng)及其表達(dá)產(chǎn)物熒光素酶等[5-8].研究表明，任何干擾或損害細(xì)菌正常生理代謝過程的因素均會對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強度產(chǎn)生不同程度的影響[9-10].因此，利用發(fā)光細(xì)菌作為指示生物監(jiān)測環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的污染風(fēng)險，已成為發(fā)光細(xì)菌的主要用途之一.發(fā)光細(xì)菌與環(huán)境急性毒性物質(zhì)的關(guān)系，以及利用海洋發(fā)光細(xì)菌作為生物傳感器的研究也是目前的熱點之一[11-12].發(fā)光細(xì)菌發(fā)光所依賴的熒光素酶是一種與細(xì)胞膜結(jié)合的糖蛋白，其與細(xì)菌呼吸代謝密切相關(guān)[13].通過改變細(xì)胞膜的滲透性、阻礙細(xì)胞膜的電子傳遞、抑制蛋白質(zhì)的合成等方式均能影響細(xì)胞呼吸鏈的正常運行，從而影響發(fā)光細(xì)菌的熒光強度.研究表明，不同鹽濃度、pH值和溫度對不同發(fā)光細(xì)菌的生長及發(fā)光產(chǎn)生不同程度的影響[14]，而不同發(fā)光細(xì)菌對環(huán)境中不同類型重金屬的敏感程度存在顯著性差異[15].因此，深入探究發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光特性是進(jìn)一步應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌的前提和基礎(chǔ).本研究通過對一株海水中分離得到的發(fā)光細(xì)菌進(jìn)行發(fā)光特性的探索，旨在發(fā)現(xiàn)該菌株的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步拓展其應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

高鹽培養(yǎng)基(固體)：酵母膏5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉30 g，磷酸氫二鈉5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，甘油0.6 g，瓊脂粉15 g，去離子水1 000 mL，pH(7.5±0.2)，高溫高壓滅菌后備用.

液體培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，氯化鈉30 g，磷酸氫二鈉5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，甘油0.6 g，去離子水1 000 mL，pH(7.5±0.2)，高溫高壓滅菌后備用.

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀0.27 g，去離子水1 000 mL，高溫高壓滅菌后備用.

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

從三亞灣近岸(E/W:109°493 472′；N/S:18°259 866′)采集海水500 mL(pH8.2，鹽度33)，將取樣的海水靜置30 min后取上清液，按一定濃度梯度稀釋后涂布于高鹽培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，在暗環(huán)境中觀察平板上菌落的發(fā)光情況，并標(biāo)記，挑取一枚發(fā)光良好的菌落，命名為L2.

1.2.2 菌株鑒定

細(xì)菌生理生化實驗參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[17].菌株16S rRNA基因保守序列使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系(50 μL)中,含有2 μL DNA模板，引物各0.5 μL，4 μL dNTPs混合液，10×PCR緩沖液5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.25 μL.擴(kuò)增前95 ℃預(yù)變性3 min，擴(kuò)增循環(huán)為95 ℃變性30 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán).擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Axygen PCR清潔試劑盒)純化后，送北京六合華大基因科技有限公司測序.

測得的菌株16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析.采用MEGA-X軟件的Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化距離使用Kimura 2-parameter模型進(jìn)行計算，系統(tǒng)發(fā)育樹使用1 000次重復(fù)的Bootstraps進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗.

1.2.3 發(fā)光強度與細(xì)菌菌量的關(guān)系

將菌株接種于固體培養(yǎng)基上，挑取單個菌落接種于5 mL液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24 h.以0.1%的接種量將種子液接種在液體培養(yǎng)基中，在30 ℃下150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)6 h，吸取1 mL菌液作為原液，使用PBS按照5倍稀釋梯度獲得不同濃度的菌液，各取200 μL加入96孔板上，每個濃度至少3個孔，用化學(xué)發(fā)光儀(Analytik Jena,ChemStudio SA2)對其進(jìn)行曝光10 min處理，之后用分析軟件VisionWorks(v8.20)對結(jié)果進(jìn)行分析，讀出熒光強度值；另外取不同濃度的菌液200 μL，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，讀取平板上的菌落數(shù)量，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算出原液及不同稀釋倍數(shù)下單位體積的細(xì)菌菌落形成單位(cfu·mL-1)，以Lg(cfu·mL-1)為橫坐標(biāo)，不同濃度菌液的熒光強度為縱坐標(biāo)，繪制發(fā)光強度與細(xì)菌菌量的關(guān)系圖，同時進(jìn)行線性回歸分析.

1.2.4 菌株生長曲線及發(fā)光強度變化曲線的繪制

以0.1%接種量將細(xì)菌L2轉(zhuǎn)接至24個含有100 mL培養(yǎng)基的三角瓶中，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h.從0 h開始，每隔1 h取1 mL菌液，10 h以后，每隔2 h取1 mL菌液.不同時間點所取的菌液分為2份，1份按10倍梯度稀釋涂平板，培養(yǎng)24 h后，讀取單菌落數(shù)量，并計算cfu·mL-1；取另一份菌液200 μL讀取發(fā)光強度.以時間為橫坐標(biāo)，Lg(cfu·mL-1)或熒光強度為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線和發(fā)光強度曲線.

1.2.5 不同培養(yǎng)溫度、pH值和氯化鈉濃度對發(fā)光強度的影響

以0.1%接種量將細(xì)菌L2轉(zhuǎn)接至不同培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度設(shè)置為15，20，25，30，35，40 ℃；初始pH值設(shè)置為4，5，6，7，8，9，10，11，12；氯化鈉濃度設(shè)置為0，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%.不同單因素條件培養(yǎng)24 h，取200 μL讀取發(fā)光強度.以時間為橫坐標(biāo)，熒光強度為縱坐標(biāo)繪制發(fā)光強度的曲線.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS(v20)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析.所有實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，并計算標(biāo)準(zhǔn)誤差，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)”表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

從圖1(a)和圖1(c)可知，L2單菌落為圓形，邊緣較光滑，中心稍微隆起，略呈乳白色，能在暗處發(fā)出藍(lán)綠色熒光.L2菌體呈短桿狀，革蘭氏染色為紫紅色，確定是革蘭氏陰性菌圖1(b).從表1可知，L2細(xì)菌不能在4 ℃或40 ℃生長，不產(chǎn)淀粉酶和明膠酶等，可以利用D-果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，接觸酶反應(yīng)為陰性，V.P試驗和吲哚試驗均顯陽性，這些特征與發(fā)光桿菌屬的鰒魚發(fā)光桿菌(P.leiognathi)較為相似.

圖1 L2菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色及其熒光圖

表1 不同菌株的生化特征分析

2.2 16S rRNA 序列分析

16S rRNA序列比對結(jié)果進(jìn)一步確定L2菌株與P.leiognathi(X74686)最為接近，相似度為96.8%，詳細(xì)結(jié)果見圖2.

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 發(fā)光強度與細(xì)菌菌量的關(guān)系

本研究用熒光/化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光細(xì)菌的熒光強度，需要確定熒光強度的檢測范圍及其與細(xì)菌菌量的關(guān)系.從圖3可知，不同濃度的細(xì)菌所產(chǎn)生的熒光強度與菌量Lg(cfu·mL-1)成較為明顯的線性關(guān)系(R2=0.962 2)，熒光強度檢測的有效范圍在(371.50±28.81)～(24 639.31±181.91).

圖3 不同細(xì)菌濃度的熒光強度及線性回歸分析

2.4 菌株生長曲線及發(fā)光強度變化曲線

如圖4所示，在5 h左右時，菌體已經(jīng)進(jìn)入生長期，此時細(xì)菌才開始發(fā)光，發(fā)光強度相對較弱，細(xì)菌發(fā)光與生長周期不同步，相對滯后，屬于非耦聯(lián)關(guān)系.培養(yǎng)5～9 h過程中，菌量逐漸升高并趨于穩(wěn)定，進(jìn)入穩(wěn)定期，而此時細(xì)菌發(fā)光強度快速增長，在9 h時達(dá)到最大值，但維持時間較短.此后，發(fā)光強度則呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，在15 h以后，發(fā)光強度下降趨勢逐步減緩，而此時細(xì)菌也進(jìn)入衰亡期，這可能是由于細(xì)菌快速增長消耗大量氧氣，而氧氣是細(xì)菌生長及發(fā)光過程中的必備條件之一.

圖4 菌株L2的生長曲線及發(fā)光曲線

2.5 發(fā)光影響因素分析

2.5.1 不同培養(yǎng)溫度對發(fā)光強度的影響

從圖5可看出，細(xì)菌L2在15～40 ℃之間均可以生長，但其發(fā)光的溫度范圍為20～35 ℃，其中30 ℃為最佳發(fā)光條件，培養(yǎng)溫度低于或超過30 ℃時，細(xì)菌生長均出現(xiàn)一定程度的下降，細(xì)菌發(fā)光強度也明顯受到抑制，尤其是溫度低于20 ℃時，熒光強度降低了約73%，這說明該菌對溫度較為敏感.

(a)熒光強度變化情況 (b)細(xì)菌生長變化情況圖5 不同培養(yǎng)溫度下L2菌株發(fā)光強度及細(xì)菌生長變化情況

2.4.3 不同氯化鈉濃度對發(fā)光強度的影響

從圖6(a)和圖6(b)可知，細(xì)菌L2在鹽濃度為0～8%之間均可以生長，屬于廣鹽性細(xì)菌.當(dāng)氯化鈉濃度為1%～4%時，細(xì)菌L2生長最為旺盛，在此范圍內(nèi)，熒光強度隨氯化鈉濃度上升而增強，氯化鈉濃度為4%時，熒光強度達(dá)到最大值，此后，熒光強度隨氯化鈉濃度上升而快速下降.當(dāng)培養(yǎng)基中沒有氯化鈉時，細(xì)菌L2完全丟失發(fā)光特性，這說明該菌的發(fā)光特性需要氯化鈉等鹽離子的參與；當(dāng)培養(yǎng)基中氯化鈉濃度達(dá)到8%時，該菌的發(fā)光特性受到強烈抑制，這有可能是過高的鹽離子濃度破壞了菌體滲透壓平衡，致使發(fā)光特性下降或丟失.

(a)熒光強度變化情況 (b)細(xì)菌生長變化情況圖6 不同氯化鈉濃度下L2菌株發(fā)光強度及細(xì)菌生長變化情況

2.4.4 不同初始pH對發(fā)光強度的影響

從圖7(a)和圖7(b)可知，細(xì)菌L2可以在pH為4～10的初始條件下生長，其中在pH為5～10的范圍內(nèi)，該菌都有不同程度的發(fā)光，初始pH為8時發(fā)光最優(yōu).同時,細(xì)菌L2在弱堿環(huán)境中比在弱酸環(huán)境中發(fā)光更強，而強堿(pH≥10)和強酸(pH≤4)都會嚴(yán)重影響細(xì)菌L2的發(fā)光特性，這可能是偏酸或偏堿環(huán)境會嚴(yán)重影響細(xì)菌的生長.

(a)熒光強度變化情況 (b)細(xì)菌生長變化情況圖7 不同初始pH下L2菌株發(fā)光強度及細(xì)菌生長變化情況

3 討論

發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光本質(zhì)是由于細(xì)菌含有熒光素酶，該酶被氧化催化后發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)從而發(fā)出一種波長約為450～490 nm的可見熒光.從20世紀(jì)開始，關(guān)于細(xì)菌發(fā)光強度的判定主要是以肉眼觀察到的結(jié)果為依據(jù)，因此,具有較強的主觀性，會影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性.后來，出現(xiàn)了專業(yè)的測光儀，對發(fā)光強度的測定有了更可靠的依據(jù).吳偉等[21]就采用DXY-1型生物發(fā)光光度計進(jìn)行測定，劉彩琴等人[22]的研究中使用了F96熒光分光光度計，從而可計算發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光強度，使結(jié)果更準(zhǔn)確.本研究采用更為先進(jìn)的熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀檢測細(xì)菌的發(fā)光強度，并利用專業(yè)分析軟件對熒光強度進(jìn)行定量分析，該方法操作簡便、快捷、準(zhǔn)確，這為今后細(xì)菌發(fā)光強度的定量分析及檢測開辟了新的途徑.

海洋發(fā)光細(xì)菌對環(huán)境pH的變化較為敏感，其生長和發(fā)光的pH范圍通常在6～8.5之間.本研究中分離到的菌株L2，可以在pH4～10的環(huán)境中生長，其中,發(fā)光范圍在5～10之間，在應(yīng)用的環(huán)境中對酸堿的耐受范圍更廣.相對于弱酸環(huán)境(pH5)來說，該菌在強堿環(huán)境(pH10)中有更好的發(fā)光特性，這可能與其自然狀態(tài)下的生境有關(guān).海水的pH一般在7.5～8.3之間，說明該菌的發(fā)光特性與自然條件基本符合.

杜宗軍等[23]從青島海洋沉積物中分離得到的一株海洋發(fā)光細(xì)菌，該菌能在氯化鈉濃度為0.5%～5%的條件下生長和發(fā)光.許鴻章等[24]發(fā)現(xiàn),有的海洋細(xì)菌可以在氯化鈉濃度高達(dá)7.5%的培養(yǎng)基中生長，但是其最適生長和發(fā)光的氯化鈉濃度為3%.本研究中分離到的菌株L2，在氯化鈉濃度為0～8%的培養(yǎng)基中均能生長，其中發(fā)光范圍在1%～7%之間，在氯化鈉濃度為4%時，發(fā)光強度值達(dá)到最大，這說明該菌株具有范圍更廣的耐鹽性，可應(yīng)用于一些高鹽度環(huán)境中的毒性監(jiān)測，如監(jiān)測鹽堿地中的環(huán)境毒性以及海水養(yǎng)殖中的生物毒性等.