高東霞　蓋廣東　張士剛　李加慶　孫付軍　桑曉光　殷曉敏　孫通華

【摘 要】 目的：觀察黃連解毒湯對人胃癌細胞株SGC-803的作用及其機制。方法：體外培養(yǎng)胃癌細胞株SGC-803，應(yīng)用黃連解毒湯干預(yù)胃癌SGC-803細胞。運用CCK-8實驗檢測SGC-803細胞增殖;劃痕實驗檢測細胞遷移能力;流式細胞儀檢測細胞凋亡水平;qRT-PCR法檢測細胞相關(guān)基因mRNA的表達水平。結(jié)果：CCK-8實驗結(jié)果表明，黃連解毒湯可有效抑制胃癌MGC-803細胞株的增殖，且呈現(xiàn)出藥物濃度依賴性及時間依賴性。劃痕實驗結(jié)果表明，黃連解毒湯干預(yù)的實驗組細胞遷移率的增長明顯慢于對照組，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，黃連解毒湯可以有效促進胃癌細胞的凋亡，實驗組MGC-803細胞的細胞凋亡率與對照組相比均有顯著性差異（P<0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)，Bax、Caspase3基因mRNA表達上調(diào)，Bcl-2基因mRNA表達下調(diào)。結(jié)論：黃連解毒湯能夠通過誘導SGC-803抑制胃癌細胞MGC-803增殖，抑制胃癌細胞遷移能力，推測其機制可能是通過影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。

【關(guān)鍵詞】 黃連解毒湯;SGC-803;細胞凋亡

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0017-04

Experimental Study on the Effect of Huanglianjiedu Decoction on SGC-803

GAO Dongxia1 GAI Guangdong1 ZHANG Shigang2 LI Jiaqing3 SUN Fujun4 SANG Xiaoguang5* YIN Xiaomin5 SUN Tonghua5

1.Yinan? Maternal and Child Health Hospital，Shandong Province，Yinan 276300，China;

2.Taian? traditional Chinese Medicine Hospital，? Shandong Province， Taian 271000，China;

3.Yinan? peoples Hospital，? Shandong Province， Yinan 2763004，China;

Shandong Institute of traditional Chinese Medicine， Shandong Province， Jinan? 250014，China;

5.Shouguang peoples Hospital，? Shandong Province， Shouguang 262700，China

Abstract：Objective To observe the effect of Huanglianjiedu Decoction on SGC-803 and its mechanism. Methods SGC-803 was cultured in vitro， and SGC-803 were interfered with Huanglianjiedu Decoction with different concentrations. CCK-8 experiment was used to detect the proliferation of SGC-803; scratch test was used to detect the cell migration ability; flow cytometry was used to detect the apoptosis level; qRT-PCR method was used to detect the cell-related gene mRNA expression level. Results The results of the CCK-8 experiment showed that Huanglianjiedu Decoction can effectively inhibit the proliferation of MGC-803， and showed drug concentration and time dependence. The results of scratch experiments showed that Huanglianjiedu Decoction interfered with the cells in the experimental group. The increase of migration rate was significantly slower than that of the control group， with a statistical difference （P<0.05）. Apoptosis detected by flow cytometry showed that Huanglian jiedu Decoction can effectively promote the apoptosis of gastric cancer cells. Compared with the control group， the apoptosis rate was significantly different （P<0.05）; qRT-PCR results showed that with the intervention of Huanglianjiedu Decoction， the mRNA expression of Bax and Caspase3 was up-regulated， and the mRNA expression of Bcl-2 was down-regulated. Conclusion Huanglianjiedu Decoction can inhibit the proliferation of MGC-803 by inducing SGC-803 and inhibit the migration ability of gastric cancer cells. It is speculated that the mechanism may be to exert anti-tumor effects by affecting the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax.

Keywords：Huanglianjiedu Decoction;SGC-803;Apoptosis

胃癌（Gastric Carcinoma， GC）是最常見的消化道系統(tǒng)腫瘤，目前仍是影響全球的一大健康問題，其發(fā)病率在腫瘤中高居第五，死亡率高居第三[1]。在我國胃癌發(fā)病率也一直居高不下。盡管早期胃癌患者可通過手術(shù)治療，然而胃癌的復發(fā)，轉(zhuǎn)移及耐藥等問題仍然令人堪憂。中藥因其表現(xiàn)出增效減毒作用，是治療惡性腫瘤中的重要組成部分，因此，尋找一種能夠提高治療胃癌療效的中藥具有重要的意義。

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，是常用清熱解毒代表方劑之一，可瀉火解毒、涼血止血?，F(xiàn)代報道該方含有小檗堿、黃芩素等[2]抗腫瘤活性成分，有明顯抑制惡性腫瘤的作用[3]。近年來已有研究把黃連解毒湯用于腫瘤治療，動物實驗證實[4-5]，黃連解毒湯對小鼠體內(nèi)、體外腫瘤生長均有抑制作用?，F(xiàn)為進一步研究黃連解毒湯抗腫瘤療效，本實驗采用體外培養(yǎng)技術(shù)，以人胃癌細胞SGC-803模型，探究黃連解毒湯抑制其增殖、遷移及凋亡情況，為黃連解毒湯治療胃癌的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子按原方比例（3∶2∶2∶3）配制而成。將全部藥物混合，浸泡，煎煮，二煎后均勻混合，置于蒸發(fā)儀上，濃縮為1.4 g/mL的黃連解毒湯;藥液1200 rpm離心兩次后取上清，置于微量離心管，1300 rpm5 min超速離心一次;集上清，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞株 SGC-803 胃癌細胞株（購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.3 試劑 胎牛血清（杭州天杭生物科技公司公司）;RPMI-1640 液體培養(yǎng)基（含10%FBS，青霉素100U/L，鏈霉素100U/L，賽默飛世爾科技公司）;CCK-8試劑盒（亞科因生物技術(shù)公司）;AnnexinV/FITC 試劑盒及線粒體膜電位試劑盒（貝博生物公司）;Bcl-2、Bax、Caspase3 等購自武漢三鷹生物技術(shù)公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 選用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行人胃癌MGC-803細胞培養(yǎng)。在37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代一次，細胞呈單層貼壁生長，在細胞達到指數(shù)增長期時開展實驗，制成單細胞懸液，按所需濃度接種使用。

2.2 CCK-8實驗檢測細胞增殖抑制率 實驗共分3組：空白組;對照組：培養(yǎng)基（90%RPMI1640+10%FBS）;實驗組：設(shè)0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%五個不同中藥濃度（用培養(yǎng)基配制）。CCK-8增殖檢測試劑盒測定細胞活力，取對數(shù)生長期MGC-803細胞制備細胞混懸液;調(diào)整細胞濃度為5×104/mL，進行細胞計數(shù);接種于96孔板，每孔加培養(yǎng)液100 μL，每孔細胞數(shù)為5000個，每組設(shè)平行6個復孔，共鋪3塊96孔板;按設(shè)計對不同實驗組細胞進行加藥，于培養(yǎng)箱中按不同時間段分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，檢測時吸出相應(yīng)的96孔板內(nèi)液體，反應(yīng)液取CCK-8和培養(yǎng)基以1∶[KG-*2]9的比例配置，每孔加入100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h;[JP3]置于全自動酶標儀中，設(shè)定參數(shù)（波長490 nm、中等強度震蕩10 min），檢測各孔的OD值。實驗重復3次，并記錄結(jié)果。抑制率（%）=[1-（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）]×100%。

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移率 對照組：RPMI-1640;實驗組：黃連解毒湯（濃度：MGC-803細胞用RPMI-1640配制）。調(diào)整細胞濃度為1.5×105/mL為細胞計數(shù);將細胞接種于6孔板，每孔2mL;待細胞密度至70%～80%時，用100μL規(guī)格槍頭劃痕;PBS輕柔洗滌2次，去除漂浮細胞;顯微鏡拍照記錄初始劃痕范圍;按設(shè)計對不同實驗組細胞進行加藥，繼續(xù)培養(yǎng);24h、48h后，再次拍照記錄細胞劃痕范圍，計算細胞遷移率。細胞遷移率=迀移距離/劃痕寬度×100%

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 對照組：培養(yǎng)基（90%RPMI1640+10%FBS）;實驗組：黃連解毒湯水提物（濃度：MGC-803細胞，用培養(yǎng)基配制）。在含90%RPMI1640+10%FBS的培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)細胞，消化細胞，離心5 min，棄上清，收集細胞;用培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度為1.5×105/mL，接種于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞，使細胞貼壁，培養(yǎng)至細胞基本覆蓋培養(yǎng)皿底部。加入黃連解毒湯的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后從培養(yǎng)箱中取出，收集細胞培養(yǎng)液，冷PBS洗滌細胞2次，消化，收集所有細胞。離心，再用PBS洗細胞2次，吸棄PBS。加入400 μL×Binding Buffer緩沖液重懸細胞;將細胞轉(zhuǎn)移至流式管中;加入 Annexin V-FITC和5 μL PI，在避光處輕輕混勻，孵育細胞15 min;1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測，記錄實驗結(jié)果。

2.5 qRT-PCR檢測細胞相關(guān)基因mRNA的表達 對照組：培養(yǎng)基（90%RPMI1640+10%FBS）;實驗組：黃連解毒湯（濃度：MGC-803細胞，用培養(yǎng)基配制）。收集黃連解毒湯水提物處理過的MGC-803細胞總RNA，以其反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參進行qRT-PCR 檢測，每組實驗重復三次。得到的數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt計算獲得細胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA 的相對表達量。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，β-actin上游引物為5′-AACAAGATGAGATTGGCA-3′，下游引物為5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′;Bcl-2上游引物為5′-CGACTTCGCCGAGATGTCCA-3′，下游引物為 5′-TTGACTTCACTTGTGGCCCA-3′;Bax上游引物為 5′-ATGATTGCCGCCGTGGACAC-3′，下游引物為 5′-CCACCCTGGTCTTGGATCCA-3′;Caspase3上游引物為 5′-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3′，下游引物為 5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA -3′。增反應(yīng)程序結(jié)束后，以2–ΔΔCt方法計算目的基因mRNA相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 25.0軟件包進行統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用檢驗χ2檢驗，P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯不同濃度、時間對MGC-803細胞増殖的抑制率 由表1可知，隨著黃連解毒湯用藥濃度及用藥時間的增加，胃癌MGC-803細胞增殖水平被逐漸抑制，呈現(xiàn)時間及濃度依賴性，與對照組、空白組比較具有顯著差異（P<0.01）。

3.2 黃連解毒湯對MGC-803細胞遷移的影響 由表2可知，在同一作用時間，黃連解毒湯干預(yù)的實驗組MGC-803細胞的遷移率較對照組顯著下降（P<0.01），提示黃連解毒湯對胃癌MGC-803細胞遷移能力明顯抑制。

3.3 黃連解毒湯不同濃度、時間對MGC-803細胞凋亡的影響 由表3可知，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，同一作用時間，不同濃度黃連解毒湯干預(yù)下MGC-803細胞的細胞凋亡率均高于對照組（P<0.01）。

3.4 黃連解毒湯對胃癌細胞相關(guān)基因mRNA表達的影響 由表4可知，qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后Bax、Caspase3 基因mRNA表達上調(diào)，Bcl-2基因mRNA表達下調(diào)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

5 討論

黃連解毒湯，君以黃連入上焦而清心除煩、入中焦而祛濕熱之邪;臣以黃芩、黃柏相伍，黃芩以攻中上焦?jié)駸?，黃柏以走下焦而除濕熱諸證;佐以梔子通瀉三焦?jié)駸?，引火下行，四藥相輔相成，共奏瀉火解毒、治療三焦火毒之效。中醫(yī)學認為，腫瘤其證多屬本虛標實，胃為倉廩之官，受納腐熟水谷，脾胃運化失司，濕熱蘊結(jié)，氣血熱毒瘀滯，胃絡(luò)被熱毒所傷而致血敗肉腐，發(fā)生病變。黃連解毒湯以清熱解毒為法，清解蘊結(jié)之熱毒，是治療胃癌的主要治法之一。本實驗采用經(jīng)典的黃連解毒湯干預(yù)胃癌MGC-803細胞，該方被證實具有抗腫瘤作用，其有效成分小檗堿、黃芩素等抗腫瘤活性成分，有明顯抑制惡性腫瘤的作用，可通過抑制腫瘤細胞分裂，從而抑制其增殖[3]。

研究以人胃癌MGC-803細胞作為研究對象，對黃連解毒湯的抗癌作用及機制進行了相關(guān)探索。實驗結(jié)果表明，隨著黃連解毒湯的濃度及用藥時間的增加，MGC-803細胞增殖水平被逐漸抑制，且呈現(xiàn)出藥物濃度及時間依賴性;在藥物作用24h、48h時，MGC-803細胞的早期、晚期凋亡率均有升高，隨給藥濃度的增高，凋亡率明顯上升，由此可見，黃連解毒湯可以有效促進胃癌細胞的凋亡，且可能主要作用于早期凋亡，并呈一定濃度相關(guān)性。細胞的增殖與凋亡始終保持動態(tài)平衡，可維持細胞群體數(shù)量的穩(wěn)定，當動態(tài)平衡被打破，細胞凋亡失常，成為腫瘤形成的重要病理基礎(chǔ)之一，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。認為黃連解毒湯通過抑制胃癌MGC-803細胞增殖，誘導其凋亡，是黃連解毒湯方降低胃癌患者復發(fā)率及轉(zhuǎn)移率的重要途徑之一。經(jīng)黃連解毒湯干預(yù)后Bax、Caspase3 基因mRNA表達上調(diào)，Bcl-2基因mRNA表達下調(diào)。報道證實[6]Bax和Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成員之一，與細胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這與本次研究結(jié)果相符，黃連解毒湯可誘導MGC-803凋亡相關(guān)蛋白表達水平發(fā)生改變，Bcl-2表達量下降，Bax表達量上升，Bcl-2/Bax比值下降。此外，有研究表明，Bcl-2/Bax在線粒體中定位決定凋亡的發(fā)生，其比值與凋亡水平有關(guān)[7]。以上研究結(jié)果表明，黃連解毒湯誘導胃癌細胞MGC-803凋亡，可能是通過線粒體途徑。本實驗揭示了黃連解毒湯抗胃癌侵襲的作用機制，為開發(fā)新型抗胃癌藥提供了中藥的理論依據(jù)，更好的將基礎(chǔ)醫(yī)學研究成果應(yīng)用至臨床工作中，從而建立最有效的治療手段。

綜上所述，黃連解毒湯能夠通過誘導細胞凋亡抑制胃癌細胞MGC-803增殖，并且還抑制胃癌細胞遷移能力。此外，還可能通過影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，細胞信號通路極其復雜，對胃癌細胞作用是否還影響信號通路及存在更多的潛在作用機制，目前仍不清楚。盡管如此，研究結(jié)果證實了黃連解毒湯具有明顯抗腫瘤作用，可能會是治療胃癌一種新的治療策略，為臨床胃癌治療提供了實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2020-05-02 編輯：劉斌）

基金項目：2020年濰坊市中醫(yī)藥科技項目（2020-4-117）。

作者簡介：高東霞（1977- ），女，漢族，本科，主治醫(yī)師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤及婦產(chǎn)科疾病。E-mail：gdx529@126.com

通信作者：桑曉光（1980- ），男，漢族，碩士，主治醫(yī)師，研究方向為消化系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail：sangxg2013@163.com