李銀　聶雨杉　彭瀟　馬雪　潘潔　陸苑　李勇軍

【摘 要】 目的：建立合歡花藥材HPLC指紋圖譜分析方法，結(jié)合模式識別與含量測定為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用HPLC法，Waters CORTECS C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm），以乙腈-0.1%磷酸水為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長270 nm。通過相似度分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析對16批合歡花指紋圖譜進(jìn)行評價，尋找合歡花的主要差異性化學(xué)成分，并測定其含量。結(jié)果：建立了合歡花藥材的指紋圖譜，確定12個共有峰，并指認(rèn)了其中3個共有峰，16批藥材相似度均大于0.90。根據(jù)聚類分析結(jié)果，可將16批藥材聚為2類，通過主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析確定槲皮苷為合歡花的主要差異性化學(xué)成分，方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于3.0%。結(jié)論：該方法精密度高、重現(xiàn)性好，可為合歡花藥材質(zhì)量控制與評價提供參考。

【關(guān)鍵詞】 合歡花;高效液相色譜法;指紋圖譜;模式識別;含量測定;質(zhì)量控制

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0046-06

Study on Fingerprint Pattern Recognition of Flower of Albizia julibrissin and Determination of the Content by HPLC

LI Yin1，2 NIE Yushan1，2 PENG Xiao1，2 MA Xue1 PAN Jie1 LU Yuan3? LI Yongjun1*

1.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM/State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;2.School of Pharmacy， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;

3. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China

Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprint analysis method of flower of Albizia julibrissin， and to provide scientific basis for its quality control by combining pattern recognition and content determination. Methods HPLC method was adopted， the determination was performed on Waters CORTECS C18 （150 mm×4.6 mm， 2.7 μm） column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphate water. The flow rate was 1.0 mL/min， and the detection wavelength was 270 nm. The fingerprints of 16 batches of flower of Albizia julibrissin samples were analyzed by similarity analysis， principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis， the main different chemical component of flower of Albizia julibrissin was searched and the content determination was conducted. Results The HPLC fingerprint of flower of Albizia julibrissin was established， and 12 common peaks were calibrated. 3 common peaks were identified， the similarity of 16 batches of medicinal materials were all higher than 0.90. Through cluster analysis， 16 batches of medicinal materials could be clutered into 2 groups， quercitrin was identified as the main different chemical component of flower of Albizia julibrissin by principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis， the methodological study in accordance with the provisions， RSD was less than 3.0%.Conclusion The method has high precision and reproducibility， which can provide reference for the quality control and evaluation of flower of Albizia julibrissin.

Keywords：Flower of Albizia julibrissin; HPLC; Fingerprint; Pattern Recognition; Content Determination; Quality Control

合歡花又名夜合歡、合歡米，為豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的干燥花絮或花蕾，其性平，味甘，歸心、肝經(jīng)，具有解郁安神、鎮(zhèn)靜催眠的功效，臨床多用于治療虛煩不眠、抑郁不舒等癥[1-3]，在華東、華南、遼寧及陜西等地均有分布[4]。合歡花化學(xué)成分主要有以異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素為代表的黃酮類化合物和揮發(fā)油等，其中槲皮苷含量最高，且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制活性，具有鎮(zhèn)靜催眠作用[5-8]。

中藥材化學(xué)成分復(fù)雜，表現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，通過單一指標(biāo)的量難以全面反映藥材質(zhì)量的優(yōu)劣[9-10]。指紋圖譜具有整體性高、特征性強(qiáng)等基本屬性，在質(zhì)量綜合評價中起到十分重要的作用，化學(xué)模式識別能對指紋圖譜的多維信息進(jìn)行分析處理，使指紋圖譜信息得以充分表達(dá)，已廣泛應(yīng)用于多種中藥的質(zhì)量控制研究[11-15]。本研究建立合歡花HPLC指紋圖譜，并對其進(jìn)行模式識別分析，結(jié)果表明槲皮苷是導(dǎo)致藥材質(zhì)量差別貢獻(xiàn)最大的化學(xué)成分，為質(zhì)量標(biāo)志性成分，因此，對槲皮苷進(jìn)行含量測定研究，以期為其質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，包括系統(tǒng)控制器、輸液泵、脫氣組件、低壓梯度組件、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、溫控樣品室、UV-DAD檢測器及Chromeleon 色譜數(shù)據(jù)工作站）;Mettler AE-240型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Multifuge X3R型高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）;WP-UP-IV-10型超純水機(jī)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥 槲皮苷對照品（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號：181216，純度：≥98%）;異槲皮苷對照品（批號：wkq18022308，純度：≥98%）、槲皮素對照品（批號：wkq18030806，純度：≥98%）均購于四川省維克奇生物科技有限公司;乙腈色譜純;其他試劑均為分析純;水為超純水。

1.3 藥材 合歡花藥材購于山東，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)劉春花副教授鑒定為豆科雙子葉植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的干燥花序或花蕾。藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脫（0～5 min，5%A～15%A，5～30 min，15%A～20%A，30～40 min，20%A～95%A）;流速：1 mL/min;檢測波長：270 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮苷、槲皮素、異槲皮苷對照品，用甲醇溶解制成1.430、0.4350、0.5250 mg/mL的對照品貯備溶液。分別精密量取上述單一對照品貯備液0.2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.0572、0.01740、0.02100 mg/mL混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，放冷，稱定質(zhì)量，補(bǔ)重，搖勻，離心10 min（12 000 r/min），即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果表明，空白對照對測定無干擾，所測指標(biāo)槲皮苷分離度R>1.5，理論塔板數(shù)按槲皮苷計不低于30000，色譜圖如圖1所示。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取槲皮苷對照品貯備液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5 mL，置2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得系列濃度對照品溶液，進(jìn)樣測定，以槲皮苷濃度（x）對峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，計算出線性回歸方程為y= 376.7x + 7.738（r=0.999 6），表明槲皮苷在0.07150～1.073 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 檢測限與定量限考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下槲皮苷對照品溶液適量，倍比稀釋，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以信噪比為3∶1、10∶1相對應(yīng)的濃度為檢測限、定量限。結(jié)果表明，槲皮苷的檢測限、定量限分別為0.07150 μg/mL、0.2383 μg/mL。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取合歡花藥材（S7）約1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以10號峰槲皮苷為參照，記錄12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.21%（n=6），相對峰面積的RSD均小于0.98%（n=6），槲皮苷峰面積的RSD為0.088%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取合歡花藥材（S7）約1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以10號峰槲皮苷為參照，記錄12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.33%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.9%（n=6），槲皮苷峰面積的RSD為0.30%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取合歡花藥材（S7）約1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以10號峰槲皮苷為參照，記錄12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），槲皮苷的平均含量為13.72 mg/g，RSD為0.30%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知槲皮苷含量的合歡花藥材（S7）6份，每份0.5 g，精密稱定，精密加入槲皮苷對照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果表明，槲皮苷的平均回收率為97.75%，RSD為0.25%（n=6）。詳見表2。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價、共有峰的指認(rèn)

2.4.1 HPLC指紋圖譜的建立 取16批合歡花藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。將得到的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進(jìn)行分析，得16批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜，如圖2、圖3所示。

2.4.2 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），進(jìn)行整體相似度評價，結(jié)果顯示，16批合歡花藥材的相似度均大于0.90，表明藥材樣品間化學(xué)成分具有良好的一致性。詳見表3。

2.4.3 共有峰的指認(rèn) 16批藥材樣品共有12個共有峰，通過與混合對照品溶液HPLC圖（圖1）比對，指認(rèn)了3個共有峰，即8號峰為異槲皮苷，10號峰為槲皮苷，12號峰為槲皮素，其中10號峰槲皮苷出峰時間、峰面積均較為穩(wěn)定，故選擇其為參照峰，計算其他共有峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間RSD均小于0.28%，表明各批次間共有峰出峰時間較為穩(wěn)定，相對峰面積RSD為0%～24.20%，說明不同批次間化學(xué)成分含量差異較大。

2.5 樣品含量測定 取16批合歡花藥材各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。詳見表4。

2.6 化學(xué)模式識別研究

2.6.1 聚類分析 （CA）采用SPSS 22.0軟件，以各共有峰的峰面積為變量，結(jié)合歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對16批藥材樣品進(jìn)行聚類分析，如圖4所示。由圖4可知，取歐氏距離為10時，16批藥材樣品可聚為2類，S1～S5、S8～S12、S15～S16聚為一類，S6～S7、S13～S14聚為一類。

2.6.2 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.1軟件，以標(biāo)準(zhǔn)化后的各共有峰的峰面積為變量，進(jìn)行主成分分析，得到主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率，詳見表5，結(jié)果表明，前兩個主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為99.275%>85%，能夠反映合歡花指紋圖譜中共有峰的大部分信息。圖5為16批藥材樣品的PCA散點(diǎn)得分圖，結(jié)果表明，16批藥材樣品可分為2類，I類樣品為S6～S7、S13～S14，II類樣品為S1～S5、S8～S12、S15～S16，該現(xiàn)象與聚類分析結(jié)果基本一致。載荷圖表明2、3、10號色譜峰對藥材的整體質(zhì)量起主要影響作用，如圖6所示。

2.6.3 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）為了更好的分析不同樣品間差異，本研究進(jìn)一步采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型進(jìn)行建模分析，結(jié)果表明，該方法將合歡花分成2類，如圖7所示。OPLS-DA模型中的擬合參數(shù)R2X=0.987，R2Y=0.829，模型預(yù)測參數(shù)Q2=0.713，均大于0.5，表明建立的數(shù)學(xué)模型穩(wěn)定可靠。以VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選導(dǎo)致質(zhì)量差異的主要標(biāo)記成分，即10號峰（槲皮苷），如圖8所示。該結(jié)果與PCA分析中載荷圖尋找的重要性權(quán)重變量大體一致，提示在合歡花藥材的利用中需重點(diǎn)關(guān)注此成分的質(zhì)量變化。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在樣品處理過程中，通過對不同提取方式（超聲、回流）、提取時間（30 min、60 min、90 min）、溶劑種類（甲醇、乙醇）進(jìn)行考察，確定了合歡花樣品制備的方法，即以75%甲醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

色譜條件考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相體系和Waters CORTECS C18、ACE Excel-5 C18等2種色譜柱對峰形、分離度的影響，發(fā)現(xiàn)選擇Waters CORTECS C18色譜柱、乙腈-0.1% 磷酸水作為流動相時色譜峰峰形良好，分離度效果最佳。進(jìn)行全波長掃描以比較不同波長下的圖譜信息，發(fā)現(xiàn)在270 nm處色譜峰數(shù)較多，因此將其作為最佳檢測波長。

本實(shí)驗(yàn)建立了合歡花HPLC指紋圖譜，確定了12個共有峰，通過對照品對其中3個化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，16批藥材相似度均大于0.90，相對保留時間RSD均小于0.28%，表明藥材整體質(zhì)量一致性較好，相對峰面積RSD范圍為0%～24.20%，化學(xué)成分含量差異較大，可能與產(chǎn)地的土壤、氣候、土質(zhì)等有關(guān)[16]。

中藥化學(xué)成分復(fù)雜，容易受諸多因素影響而導(dǎo)致質(zhì)量的優(yōu)劣差異，模式識別則為建立更加完整和科學(xué)的中藥質(zhì)量評價體系提供一個新的思路[17]。因此，為更好的辨別藥物之間的質(zhì)量差異，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合CA、PCA、及OPLS-DA三種模式識別方法對合歡花指紋圖譜進(jìn)一步分析，根據(jù)聚類分析與主成分分析結(jié)果，16批合歡花藥材被分成2類，S1～S5、S8～S12、S15～S16為一類，S6～S7、S13～S14為一類。表明指紋圖譜可能與生長環(huán)境和采收季節(jié)存在一定的相關(guān)性，而導(dǎo)致藥材不同批次之間分類上的差異。經(jīng)OPLS-DA分析，篩選到了1種差異性質(zhì)量標(biāo)志成分，即10號峰。槲皮苷含量測定的結(jié)果顯示，S16樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.33%，其余15批次樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.77%～1.31%，可見合歡花藥材雖為同一產(chǎn)地，但不排除因?yàn)椴墒諘r間、貯藏條件的不同造成含量差異的可能。因此，合歡花藥材的質(zhì)量控制應(yīng)從產(chǎn)地采收、加工等源頭著手，需重點(diǎn)關(guān)注槲皮苷含量的變化，嚴(yán)格把控藥物質(zhì)量。

本研究通過指紋圖譜與化學(xué)模式識別結(jié)合的方式，找出影響合歡花整體質(zhì)量的差異性成分，并對其進(jìn)行含量測定，揭示了合歡花的內(nèi)在質(zhì)量，該方法簡便易行，同時具有靈敏度高、特征性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，從多角度較為全面、系統(tǒng)的對藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，同時也為藥材的合理利用提供依據(jù)。

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（收稿日期：2020-04-14 編輯：程鵬飛）

基金項(xiàng)目：貴州省科技計劃項(xiàng)目（20162820）;貴州省創(chuàng)新人才團(tuán)隊項(xiàng)目（20165613/20165677）;中央引導(dǎo)地方科技專項(xiàng)項(xiàng)目（20184006）。

作者簡介：李銀（1997-），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制技術(shù)研究。E-mail： 2681282643@qq.com

通信作者：李勇軍（1973-），男，漢族，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制技術(shù)研究。E-mail： liyongjun026@126.com