劉曉蕾　張艷

【摘要】 目的 探討參草通脈顆粒治療慢性心力衰竭（CHF）的療效機制。方法 80只SPF級SD雄性大鼠應用冠脈結扎法， 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）方法， 隨機選取10只為正常組， 造CHF大鼠模型后剩余59只大鼠隨機分為模型組（19只）， 參草通絡顆粒組（20只）， 賴諾普利組（20只），?測定大鼠血清中Dickkopf-1（DKK1）、分泌型卷曲相關蛋白1（sFRP1）和Wnt抑制因子-1（WIF1）水平。

結果 模型組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平分別為（3.48±0.82）、（191.56±3.78）、（55.16±0.94）μg/L均高于正常組的（1.59±0.08）、（86.84±4.02）、（22.58±0.95）μg/L、賴諾普利組的（2.87±0.27）、（169.75±2.89）、（46.41±2.12）μg/L及參草通脈顆粒組的（2.25±0.09）、（126.36±6.37）、（36.18±2.06）μg/L;且賴諾普利組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平均高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

結論 參草通脈顆粒通過調控Wnt通路抑制劑， 可以有效發(fā)揮治療CHF的作用。

【關鍵詞】 慢性心力衰竭;參草通脈顆粒;分泌性卷曲相關蛋白-1;Wnt抑制因子-1;Dickkopf-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.28.093

CHF是多種心臟疾病的終末期表現。Wnt信號通路是近年來研究的熱點， 在CHF發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現Wnt信號通路抑制因子可阻斷Wnt信號通路傳導， 對心臟具有保護作用[1， 2]。參草通脈顆粒是臨床應用30余年治療CHF的經驗方， 通過多年的臨床觀察和試驗， 參草通脈顆粒對CHF患者療效確切[3]。本實驗通過檢測Wnt傳導通路抑制因子DKK1、sFRP1、WIF1， 探討參草通脈顆粒治療CHF的療效機制， 現將結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 選取15周齡， 80只SPF級SD雄性大鼠， 體重為250～300 g， 由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1. 2 藥物制備 參草通脈顆粒（神威藥業(yè)集團有限公司， 國藥準字Z20055492）組成：丹參、人參、黃芪、紅花、三七粉、益母草、茯苓、葶藶子處方中的全部藥材均符合參照國家藥典2010版有關規(guī)定。賴諾普利片（國藥集團汕頭金石制藥有限公司， 國藥準字H20065768）。

1. 3 實驗試劑和儀器 DKK1、sFRP1、WIF1蛋白測定的ELISA試劑盒， 低溫高速離心機， 酶標儀等。

1. 4 CHF大鼠動物模型制備 大鼠正常條件下適應喂養(yǎng)7 d后， 為全部動物編號后隨機抽取10只為正常組。其余大鼠禁食不禁水12 h后， 腹腔麻醉， 氣管插管， 設置呼吸機參數（潮氣量：0.7 ml/kg， 頻率：80次/min），?消毒后在左側第3、4肋間橫向切開長約1～2 cm， 逐層分離， 暴露視野可見心臟， 用縫合線結扎距離左冠脈前降支起始點2～3 mm處， 心電圖提示胸導ST段和T波出現明顯異常， 說明結扎成功， 將心臟送回胸腔， 用注射用青霉素鈉（哈藥集團制藥總廠， 國藥準字H23021439）手術切口處敷用， 大鼠生命體征平穩(wěn)后， 撤掉呼吸機。預防術后感染， 連續(xù)3 d應用注射青霉素鈉30萬IU， 1次/d。正常飼養(yǎng)1周后， 喂養(yǎng)飼料減少1/2;同時大鼠進行力竭式游泳1次/d， 連續(xù)4周。經超聲檢測左室射血分數（LVEF）≤60%， 可以判定為心力衰竭， 同時列入觀察對象[4]。

1. 5 實驗分組與給藥 大鼠在造模前、后共死亡11只， 將剩余59只大鼠， 按照隨機數字表法分成模型組（19只）、參草通脈顆粒組（20只）、賴諾普利組（20只）， 空白對照組為正常喂養(yǎng)未手術造模的大鼠?？瞻讓φ战M和模型組大鼠不用藥， 灌胃生理鹽水10 ml/kg， 1次/d。其余組大鼠用藥劑量， 按人鼠劑量換算公式， 劑量（g/kg）=藥品劑量（人口服）（g）×0.018/動物體重（kg）[5]，?計算出賴諾普利組服用生藥劑量為1.5 mg/（kg·d）， 參草通脈顆粒組服用生藥劑量為9.2 g/（kg·d）， 兩組藥溶于3 ml蒸餾水1次/d灌胃， 各組連續(xù)給藥42 d。

1. 6 實驗取材 大鼠麻醉、處死， 腹主動脈取血， 離心， 收集上清液， 分裝后低溫保存， 用于檢測DKK1、sFRP1、WIF1蛋白濃度。

1. 7 方法 采用ELISA法， 測定比較各組大鼠血清DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平。按照試劑盒說明及儀器要求的操作步驟進行。

1. 8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 各組大鼠血清DKK1蛋白水平比較 模型組的DKK1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的DKK1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 各組大鼠血清sFRP1蛋白水平比較 模型組的sFRP1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的sFRP1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 各組大鼠血清WIF1蛋白水平比較 模型組的WIF1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的WIF1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

在CHF發(fā)病機制過程中Wnt信號通路是近年一直研究的熱點， Wnt信號通路主要由Wnt蛋白、細胞膜受體、胞漿內信號轉導部分和核內轉錄調控部分組成， 分為經典和非經典Wnt通路[6]。研究發(fā)現[7， 8]， CHF發(fā)生過程中， 在經典通路， Wnt蛋白與受體LRP5/6和FZD結合， 激活Wnt-β-catenin信號通路， 誘導心肌細胞肥大。非經典通路， Wnt蛋白與受體FZD結合， 激活Wnt/Ca2+和Wnt/PCP/JNK信號通路， 促進心肌肥厚的發(fā)生[9]。DKK1、sFRP1、WIF1是Wnt信號通路抑制劑， 通過不同途徑影響Wnt配體-受體的結合， 調節(jié)Wnt信號通路轉導[10]。DKK1可以抑制Wnt蛋白配體與受體LRP5/6結合， 阻斷Wnt信號通路轉導[11]。而sFRP1和WIF1先與Wnt蛋白結合， 阻止Wnt蛋白與FZD受體結合， 亦阻斷Wnt信號通路傳導[12]。因此DKK1、sFRP1、WIF1通過阻斷Wnt信號通路傳導， 可延遲CHF的發(fā)生和發(fā)展， 對心臟具有保護作用。

參草通脈顆粒是多年臨床治療CHF的經驗方， 作者團隊前期對280例CHF患者臨床試驗研究， 結果證明參草通脈顆粒可明顯改善患者心功能分級， 提高LVEF水平[12]。該藥物由黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子、茯苓組成。藥理學研究表明[13]， 黃芪對心肌活性亦有保護作用， 它已用于CHF的治療， 黃芪甲苷是正性肌力作用的主要活性成分， 對心力衰竭患者具有改善心肌舒縮功能、排鈉利尿、抑制心肌重構、改善心肌能量代謝、抑制心肌細胞凋亡、抑制氧化應激、抑制纖維化等多種作用。人參治療CHF過程中， 人參皂苷成分起主要作用， 研究表明[14]， 人參皂苷也可降低心力衰竭大鼠心肌膠原含量， 抑制心肌纖維化改善心室舒、縮功能。紅花的有效成分紅花黃色素， 具有興奮心臟作用， 使心跳有力， 振幅加大， 增加冠狀動脈血流量和降低冠狀動脈阻力， 改善心肌缺血[15]。丹參有效成分為丹參酮Ⅱ， 通過影響心肌細胞Ca2+內流， 阻斷信號轉導， 抑制心室肥厚[16]。益母草中鹽酸水蘇堿成分能降低心臟指數、左心室指數和心肌細胞橫截面積， 還能夠抑制肥厚心肌組織心房肽（ANP）和腦鈉素（BNP）的表達， 對心肌肥厚具有一定的抑制作用[17]。三七的有效成分是三七總皂苷， 三七總皂苷可以顯著提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性， 改善離子轉運， 抑制心肌間質細胞膠原增生， 抑制心肌肥厚[18]。葶藶子具有顯著的利尿作用， 增加心臟輸出量減輕心臟負荷， 同時葶藶子能抑制神經內分泌系統(tǒng)的過度激活， 防止心室重構[19]。茯苓素作為茯苓的主要活性成分， 是新的醛固酮受體拮抗劑， 體外可競爭醛固酮受體， 體內逆轉醛固酮效應， 具有利尿消腫的作用[20]。

本實驗結果顯示， 模型組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。提示是機體應對心臟結構改變和CHF發(fā)生的一種負反饋現象。經藥物干預后， 參草通脈顆粒效果較優(yōu)。

綜上所述， 參草通脈顆粒對Wnt信號通路抑制劑的表達水平有明顯調控作用， 闡明了參草通脈顆粒治療CHF作用機制， 為CHF患者的臨床治療提供了理論基礎。

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[收稿日期：2020-05-06]