祁馳恒，許娟妮，尼瑪卓嘎，曾鈺婷

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850032）

馬鈴薯是西藏自治區(qū)繼青稞、小麥之后的第三大糧食作物，是重要的糧菜兼用和工業(yè)原料作物，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)在脫貧攻堅、農(nóng)牧民增收、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整等方面具有重要的作用[1]。西藏自治區(qū)馬鈴薯主栽品種仍以地方品種為主，存在品種單一、退化嚴(yán)重等問題，迫切需要加強(qiáng)種質(zhì)資源的開發(fā)與利用，選育與引進(jìn)高產(chǎn)、高抗、優(yōu)質(zhì)、適宜西藏自治區(qū)生態(tài)條件的馬鈴薯新品種，以促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。因此，明確西藏自治區(qū)馬鈴薯地方品種的遺傳多樣性、遺傳差異，對新品種引進(jìn)與新品種選育過程中的親本選配具有重要意義。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基因分型的成本持續(xù)降低，基因測序分型（Genotyping-by-sequencing，GBS）技術(shù)作為第二代深度測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的簡化基因組測序技術(shù)，通過采用酶切加標(biāo)簽的方法，使多樣本高通量平行測序得以實現(xiàn)[2,3]，目前，GBS技術(shù)已在遺傳學(xué)研究、圖譜構(gòu)建和種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[4,5]。國內(nèi)對馬鈴薯遺傳多樣性分析報道較多，而針對西藏自治區(qū)馬鈴薯遺傳多樣性研究則鮮見報道[6-8]。本研究利用GBS技術(shù)對西藏自治區(qū)24份馬鈴薯地方品種和1個主栽品種的遺傳多樣性展開研究，以揭示西藏自治區(qū)馬鈴薯地方品種的親緣關(guān)系及遺傳特性，探討其遺傳多樣性水平，為西藏自治區(qū)馬鈴薯種質(zhì)資源開發(fā)與利用、新品種引進(jìn)與選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為24個西藏自治區(qū)地方品種和1個主栽品種（‘青薯9號’），見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取和GBS文庫構(gòu)建

每個供試品種選取5 株，共125 個樣本。利用天根生化科技有限公司的基因組DNA 提取試劑盒（DNAsecure Plant Kit）提取DNA。經(jīng)濃度及純度檢測后的高質(zhì)量DNA 用于GBS 文庫的構(gòu)建和測序，采用限制性內(nèi)切酶PstI-HF/MspI對DNA進(jìn)行酶切，酶切后的片段兩端用T4 連接酶加接頭和Barcode，回收300～500 bp的DNA片段，對回收片段使用高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用Qubit 測定PCR 產(chǎn)物濃度，濃度需大于5 ng/μL，將混好的文庫上機(jī)（Illumina Hiseq Xten，PE150）測序。

1.2.2 SNP鑒定

為了保證分析質(zhì)量，將混池下機(jī)Raw Reads使用FastQC（v0.11.7）軟件對多樣品混池下機(jī)Raw Reads 進(jìn)行質(zhì)控；使用了Stacks（v2.1）軟件包中的process_radtags程序（主要參數(shù)-r--renz_1--adapter_mm 1），剔除混池下機(jī)Raw Reads 含有接頭序列的Reads，并依據(jù)建庫樣品與Barcode 對應(yīng)關(guān)系拆分為單樣品 Raw Reads；使用 FASTX Toolkit（v0.0.14）軟件包中的fastx_trimmer 程序（主要參數(shù)-f-l），移除酶切位點序列以及3' 端FastQC 質(zhì)控質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20 的所有堿基，得到Clean Reads。使用Bowtie2 軟件將Clean Reads 比對到參考基因組上（http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/data/potato_dm_v404_all_pm_un.fasta.zip），基于樣品與參考基因組的比對結(jié)果，利用GATK軟件HaplotypeCaller程序生成每個樣品中的gVCF 文件，再通過GATK 軟件GenotypeGVCFs 程序進(jìn)行群體單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測。對得到的群體SNP 數(shù)據(jù)使用GATK 軟件SelectVariants 程序?qū)︻A(yù)測結(jié)果進(jìn)行篩選。為了降低SNP和INDEL檢測的錯誤率，使用VCFtools 軟件對獲得SNP 和INDEL分型結(jié)果進(jìn)行過濾。過濾條件如下：Reads 支持?jǐn)?shù)（DP）不低于4；剔除MAF 小于0.01 的位點；剔除SNP或者INDEL分型缺失率高于20%的位點。

表1 試驗材料Table 1 Test materials

1.2.3 遺傳數(shù)據(jù)統(tǒng)計

期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC），有效等位基因數(shù)（Ne）分別由以下公式計算獲得：

式中xi2為第i 個等位基因的頻率，k 為等位基因數(shù)。

式中 i，j 為第 i、j 個等位基因；Pi和 Pj分別為群體中第i 個和第j 個等位基因頻率，n 為等位基因數(shù)。

式中Pi為第i個有效等位基因的頻率，n為等位基因數(shù)。

采用VCFtools 軟件計算核苷酸多樣性（Pi）、計算哈溫平衡P 值，使用R 包Genepop 計算群體間的遺傳分化系數(shù)（Fst），群體間的Reynolds'遺傳距離（Reynolds'genetic distance，DR）則由 Fst 估算得出，DR=-ln（1-Fst）。采用鄰接法（Neighbor-joiningmethod）構(gòu)建進(jìn)化樹，通過TreeBeST軟件計算距離矩陣，進(jìn)化樹的可靠性通過Bootstrap 法進(jìn)行檢驗（重復(fù)1 000次），使用Plink2 軟件對獲得的SNP 標(biāo)記進(jìn)行PCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量

GBS測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基識別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列，125個馬鈴薯樣本的總測序數(shù)據(jù)量為140.64 Gb，去除低質(zhì)量的序列后，產(chǎn)生的高質(zhì)量序數(shù)據(jù)量為130.22 Gb，平均每個樣本數(shù)據(jù)量為1 042 Mb，測序質(zhì)量較高（Q20 ≥94.63%，Q30 ≥87.16%），GC含量分布正常。全部樣本與參考基因組的比對率為76.0%～85.39%，平均測序深度為56.26×，覆蓋度為1.05%～3.08%。經(jīng)過SNP calling 并過濾，共獲得93 435 個SNP 位點，4 653 個 INDEL 位點。

2.2 供試品種遺傳多樣性

25個馬鈴薯品種的觀測雜合度（Ho）為0.24，期望雜合度（He）為0.19，與Ho 相差不大。觀測等位基因數(shù)（Na）為2，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.29，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.16，核苷酸多態(tài)性（PI）為0.19，哈溫平衡P值為0.61，P ＞0.05說明達(dá)到了遺傳平衡。

2.3 品種間遺傳分化和遺傳距離分析

由表2 可知，各品種間Fst 值小于0.05 占10%，0.05～0.15 的占5%，0.15～0.25 的占36%，大于0.25的占49%。品種間分化系數(shù)Fst值越低對應(yīng)遺傳距離越近，F(xiàn)st值越高則對應(yīng)遺傳距離越遠(yuǎn)。‘艾瑪白’、‘拉多’、‘瓊林白’、‘察隅’、‘普蘭科白’、‘亞東’、‘賽幫白’和‘洛扎’8 個品種間Fst 值在0.000 6～0.005 4，‘艾瑪白’與其他17個品種的Fst值在0.206 8～0.301 4，‘青薯9 號’與其他品種的Fst值在0.155 8～0.246 0，平均為0.218 9，‘陳塘紅’與其他品種的Fst值在 0.215 6～0.316 7，平均 Fst 值最高，為 0.289 4?！愄良t’（0.289 4）、‘芒康’（0.271 1）、‘下亞東’（0.252 6）、‘普蘭科紅’（0.257 8）、‘艾瑪紅’（0.267 9）、‘工布’（0.269 0）、‘昌果紅’（0.278 1）、‘吉隆吉普’（0.268 6）、‘吉德秀’（0.272 8）和‘米林’（0.263 1）10個品種的平均Fst 值大于0.25，遺傳距離DR 值在0.291 9～0.342 5?！敯住?.172 2）、‘拉多’（0.172 1）、‘瓊林白’（0.171 8）、‘察隅’（0.173 0）、‘普蘭科白’（0.173 1）、‘亞東’（0.172 5）、‘賽幫白’（0.172 8）和‘洛扎’（0.173 3）8個品種的平均Fst值小于0.18，DR值在0.197 9～0.199 7?！∽忧邪汀汀X拉’的平均Fst 值分別為0.180 5 和0.189 9，其他5 個品種的平均Fst值在0.20～0.25，DR值在0.240 2～0.253 6。

2.4 進(jìn)化樹分析

arieties me v so R）etween（D) b離距遺istance (DR傳st）和（F數(shù)genetic d系化分遺傳t (Fst) and的間種efficien品co分部2表ifferentiation etic d en ble 2 G Ta紅 C h a n g g u o h ong 果昌布G o n g b u 工紅 E m m y h o n g 瑪艾東Y a d o n g 亞龍D u i l o n g 堆紅 P u l a n k e h o n g 科蘭普林M i l i n 米東 X i a y a d o n g 亞下白 P u l a n k e b ai科蘭普隅C h a y u 察白 Q i o n g l i n b ai 林瓊康M a n g k a n g 芒多L a d u o 拉白 C h a g u o b a i 果查種V a r i e t y 品0.371 1 0.345 6 0.331 4 0.344 2 0.347 7 0.347 3 0.342 3 0.368 5 0.324 8 0.365 1 0.346 2 0.319 7 0.306 7-0.303 7 0.299 1 0.292 4 0.263 2 0.291 8 0.247 3 0.194 8 0.303 0 0.163 3 0.249 5 0.292 3 2 4 0.36 9 5 0.33 5 3 0.31 9 7 0.33 2 1 0.34 1 9 0.34 0 9 0.31 0 6 0.35 1 7 0.33 7 1 0.35 1 2 0.34 0 9 0.32-4 1 0.26 6 8 0.27 8 8 0.29 9 4 0.28 8 1 0.24 9 0 0.28 0 4 0.24 1 8 0.10 4 2 0.31 3 0 0.18 2 5 0.22 9 1 0.28 5 3 0.33 8 4 0.32 3 5 0.33 8 1 0.32 0 6 0.33 0 3 0.33 8 3 0.31 9 8 0.33 9 1 0.30 0 5 0.33 9 5 0.32-4 5 0.27 3 6 0.27 0 3 0.29 5 6 0.28 0 6 0.28 2 6 0.24 1 0 0.28 4 7 0.23 7 6 0.18 4 8 0.30 8 8 0.17 4 9 0.23 0 4 0.28 6 1 0.15 1 1 0.00 3 2 0.33 0 8 0.00 1 7 0.00 2 5 0.00 4 2 0.29 9 2 0.29 5 8 0.30 3 6 0.15-0 7 0.28 9 1 0.28 2 6 0.29 7 3 0.26 6 2 0.27 2 7 0.00 8 9 0.22 2 7 0.00 8 4 0.21 0 4 0.20 2 3 0.30 7 0 0.20 7 9 0.21 0 6 0.00 0.002 7 0.153 9 0.339 8 0.153 7 0.154 0 0.155 1 0.309 4 0.315 0 0.316 6-0.142 4 0.281 4 0.300 3 0.305 9 0.283 6 0.290 5 0.144 1 0.232 0 0.142 1 0.232 3 0.206 5 0.312 9 0.211 2 0.222 1 0.142 5 0.320 6 0.305 0 0.326 1 0.304 2 0.307 1 0.306 5 0.322 8 0.332 0-0.271 4 0.263 5 0.265 9 0.282 3 0.277 3 0.297 1 0.292 9 0.263 1 0.234 9 0.263 4 0.237 1 0.141 4 0.306 8 0.155 8 0.207 6 0.262 7 0 8 0.32 8 3 0.29 1 6 0.34 7 6 0.29 9 3 0.29 1 2 0.30 8 3 0.30-2 5 0.28 0 2 0.27 8 6 0.25 8 1 0.28 5 7 0.29 8 2 0.30 6 6 0.26 9 8 0.27 8 9 0.25 4 2 0.23 8 5 0.25 4 3 0.23 3 9 0.20 0 4 0.31 1 2 0.21 2 7 0.23 8 2 0.25 0.314 3 0.294 0 0.318 7 0.292 8 0.295 0 0.295 4-0.265 3 0.275 9 0.266 1 0.254 9 0.272 6 0.267 2 0.289 9 0.271 8 0.274 2 0.255 0 0.222 0 0.255 5 0.169 4 0.186 5 0.299 4 0.197 1 0.221 8 0.254 6 0.157 0 0.002 2 0.333 7 0.001 3 0.002 0-0.255 8 0.260 1 0.264 0 0.143 7 0.002 5 0.281 3 0.289 6 0.293 4 0.267 9 0.277 7 0.001 7 0.229 6 0.005 4 0.218 1 0.200 0 0.302 9 0.207 1 0.218 5 0.000 7 6 4 0.15 1 3 0.00 3 4 0.33 2 1 0.00-2 0 0.00 5 5 0.25 8 7 0.25 4 4 0.26 2 7 0.14 1 7 0.00 1 5 0.28 9 7 0.28 3 7 0.29 7 7 0.26 6 9 0.27 2 3 0.00 9 1 0.22 4 3 0.00 9 1 0.21 0 6 0.20 2 7 0.30 7 9 0.20 9 0 0.21 1 5 0.00 5 4 0.15 0 9 0.00 1 4 0.33-2 1 0.00 1 3 0.00 3 8 0.25 7 4 0.25 23 0 0..12 46 2 5 0 8 0.00 9 7 0.27 8 0 0.28 1 2 0.29 5 6 0.26 5 3 0.27 1 8 0.00 7 7 0.22 4 7 0.00 7 4 0.21 8 9 0.19 1 0 0.30 6 2 0.20 6 8 0.21 1 5 0.00 0.345 9 0.331 6-0.282 1 0.283 5 0.283 7 0.272 9 0.289 4 0.278 3 0.288 1 0.283 4 0.283 6 0.270 4 0.282 1 0.298 2 0.293 5 0.282 9 0.239 2 0.283 2 0.244 8 0.189 9 0.311 9 0.195 1 0.212 0 0.282 5 5 4 0.15-2 2 0.28 0 9 0.00 1 3 0.00 2 2 0.00 4 7 0.25 7 9 0.25 2 9 0.26 2 6 0.14 1 1 0.00 9 9 0.27 7 9 0.28 2 2 0.29 6 6 0.26 5 6 0.27 2 2 0.00 8 7 0.22 4 2 0.00 8 1 0.21 9 1 0.19 1 3 0.30 6 8 0.20 7 3 0.21 1 4 0.00-0.143 9 0.292 4 0.143 9 0.144 8 0.145 3 0.269 7 0.274 4 0.274 3 0.002 7 0.144 5 0.284 9 0.304 0 0.310 0 0.287 4 0.294 4 0.144 6 0.235 2 0.145 5 0.233 7 0.207 6 0.316 7 0.213 2 0.224 9 0.144 2 aguobai g Pulankeb glinhong ai on angguohong Jilongjipu a白Xiayadong Mangkang Ch Pulankeh glinbai mahong ai白Laduo Qion Qingshu 9 Longziqieb巴Ch ayu東Milin紅ilong Yadong Em紅Gongbu Ch普J(rèn)idexiu Saibangb Qion gdu entanghong mabai白Ch an科Du Em ozha科紅吉秀白紅L u 9號切紅Juela Ch白果多康林隅蘭亞林蘭龍東瑪布果隆德幫林扎薯子塘拉都瑪查拉芒瓊察普下米普堆亞艾工昌吉吉賽瓊洛青隆陳覺昌艾)between varieties.etic distance(DR DR）。er triangle is the gen（離距傳st),and the upp遺(F間種品為角三上Fst），ifferentiation coefficient（數(shù)系化分傳遺間種品為三he lower triangle is the genetic d角注Note:T下：

由圖1可知，可將25個馬鈴薯品種劃分為3個類群。第Ⅰ類群和第Ⅱ類群各包括10個馬鈴薯品種，第Ⅲ類群包括5個馬鈴薯品種。西藏自治區(qū)當(dāng)?shù)刂髟云贩N‘艾瑪白’與‘查果白’、‘堆龍’、‘洛扎’、‘亞東’、‘察隅’、‘瓊林白’、‘拉多’、‘賽幫白’、‘普蘭科白’聚集到第Ⅰ類群，‘青薯9號’與‘昌果紅’、‘覺拉’、‘隆子切巴’、‘工布’、‘艾瑪紅’、‘芒康’、‘普蘭科紅’、‘昌都’、‘下亞東’聚集到第Ⅱ類類群，‘陳塘紅’、‘瓊林紅’、‘吉德秀’、‘吉隆吉普’和‘米林’聚集到第Ⅲ類群。每一類群都有不同地理來源的馬鈴薯品種，同一地理來源的地方品種分散聚集于不同類群，表明類群聚集與地理來源無明顯相關(guān)性。

2.5 主成分分析

主成分分析是基于個體基因組SNP 差異程度，按照不同性狀特征將個體按主成分進(jìn)行聚類成不同的亞群，同時與其他聚類方法的結(jié)果相互驗證。由圖2可知，‘查果白’和‘堆龍’聚集，與第Ⅰ類群的其他品種相距較近，第Ⅰ類群的10個品種首先與其他品種分開；第Ⅱ類群中的品種間相距較遠(yuǎn)，‘普蘭科紅’、‘隆子切巴’和‘覺拉’聚集，與其他品種相距較遠(yuǎn)；第Ⅲ類群中的5個品種比較分散，‘米林’和‘基隆吉普’與第Ⅱ類群的多數(shù)品種相距較近，‘陳塘紅’與所有參試品種距離較遠(yuǎn)。由此可看出，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹的分類結(jié)果基本一致。

3 討 論

馬鈴薯遺傳多樣性分析研究方法以Amplified fragment length polymorphism（AFLP）、Simple sequence repeats（SSR）、Random amplifiedpolymorphic DNA（RAPD）和Inter-simple sequence repeat（ISSR）標(biāo)記較為多見。這些分子標(biāo)記方法技術(shù)成熟，支持文獻(xiàn)豐富，但存在試驗過程繁瑣、所選標(biāo)記在基因組中的覆蓋度低等不足[9]。GBS技術(shù)相比傳統(tǒng)分析方法，選用的遺傳標(biāo)記數(shù)量多，能夠覆蓋全基因組，可全面、準(zhǔn)確地揭示研究物種的遺傳特征。目前該方法已在柑橘[10]、煙草[11]、玉米[12]、托氏琩螺[9]等物種進(jìn)行了群體多樣性分析，具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本研究通過GBS技術(shù)對125個馬鈴薯樣本進(jìn)行測序，產(chǎn)生的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)量為130.22 Gb，共獲得93 435個高質(zhì)量的SNP位點用于后續(xù)遺傳多樣性分析。

遺傳多樣性是生物遺傳物質(zhì)DNA 的多樣性，生物遺傳多樣性越高，包含的基因就越豐富，該物種的抗病性、抗逆性及對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)[13]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，中國馬鈴薯品種都不同程度存在親緣關(guān)系較近和遺傳多樣性不足的情況。李建武等[6]利用11對SSR引物對42份甘肅省主栽的馬鈴薯品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明甘肅省主栽馬鈴薯品種之間的遺傳相似性較高，遺傳基礎(chǔ)較狹窄；滕長才等[7]利用30對SSR引物對12份青海省馬鈴薯主栽品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，認(rèn)為遺傳多樣性水平較低；趙光磊等[8]利用20 對SRAP 引物對34 份黑龍江馬鈴薯主栽品種遺傳多樣性進(jìn)行分析，顯示遺傳相似性較高，遺傳多樣性程度較低。

等位基因數(shù)（N）、雜合度（H）是評估遺傳多樣性的主要指標(biāo)，值越高，說明其受到的選擇壓力越小，其遺傳多樣性越豐富[14]。Ghislain 等[15]通過將PIC 數(shù)值劃分為 3 個區(qū)間 PIC ＞ 0.5，0.25 ＜ PIC ＜ 0.5和PIC ＜0.25 來對應(yīng)引物多態(tài)性程度的高、中和低，以此來衡量基因變異程度的高低。劉易科等[16]利用SNP芯片技術(shù)分析小麥品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明，PIC 值的變幅為0.01～0.38，平均值為0.26，育成的品種遺傳基礎(chǔ)不夠豐富，蔡露等[11]利用GBS 技術(shù)對92 份煙草種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣分析，Na 為 1.27～1.93，Ho 為 0.22～0.76，He 為 0.32～0.59，整體遺傳多樣性偏低。本研究中供試馬鈴薯品種的 Ho 為 0.24，He 為 0.19，Ne 為 1.29，PIC 為0.16，PI 為0.19，均表現(xiàn)較低，表明參試品種的遺傳多樣性較低。

西藏自治區(qū)地域廣闊，東西跨度大，邊境線長，馬鈴薯地方品種間應(yīng)更易產(chǎn)生遺傳分化，但隨著交通的便利，各地品種間的交流越來越頻繁，從而導(dǎo)致部分品種資源的浪費及遺傳分化的較少。Wright[17]提出，遺傳分化指數(shù) Fst 介于 0～0.05 的種群遺傳分化很小，0.05～0.15 的種群遺傳分化中等，0.15～0.25 的種群遺傳分化很大，大于0.25 表明種群遺傳分化極大。本研究中10 個馬鈴薯品種的Fst值大于0.25，與其他參試品種有很大的遺傳分化，遺傳距離大，遺傳背景差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。平均值較小的8個品種間Fst值小于0.05，遺傳分化很小，遺傳距離短。本研究中25 個馬鈴薯品種的遺傳分化水平整體較高，遺傳距離較遠(yuǎn)，但部分品種間的遺傳分化很低，遺傳距離近，可能與地方品種間的交流有關(guān)。

基于遺傳分化系數(shù)、進(jìn)化樹和主成分分析，25個馬鈴薯品種劃分為3個類群。第Ⅰ類群中品種間遺傳分化較小，遺傳距離較近，親緣關(guān)系較近；第Ⅱ類群中的品種遺傳分化較大，遺傳距離較遠(yuǎn)；第Ⅲ類群中的品種遺傳分化很大，遺傳距離遠(yuǎn)，每個品種單獨聚集，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；且類群聚集與地理來源無明顯相關(guān)性。系統(tǒng)進(jìn)化樹中部分品種的5株并沒有聚合在一起，表明5個樣品間存在差異，這與地方品種的混亂有關(guān)，5個樣品的表型性狀相同或相似，但在基因?qū)用鎱s存在一定差異，地方品種間存在同名異物與同物異名的現(xiàn)象。

綜上所述，西藏自治區(qū)馬鈴薯地方品種遺傳多樣性較低，部分品種間親緣關(guān)系較近。本研究結(jié)果有助于了解西藏自治區(qū)馬鈴薯地方品種的遺傳多樣性水平，為豐富馬鈴薯種質(zhì)資源，利用及保護(hù)馬鈴薯地方品種提供依據(jù)。