王 淋，敖 敦，包文泉，張淑寧，陳俊興，李鳳鳴，孟繁慶，楊鈺瑩，白玉娥

（1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

桃Amygdalus persicaL.Batsch 為薔薇科Rosaceae 李屬Prunus桃亞屬Amygdalus多年生落葉樹種，原產(chǎn)自中國(guó)，是世界四大果樹之一[1]。作為桃的原產(chǎn)地，我國(guó)具有極其豐富的桃種質(zhì)資源，其桃產(chǎn)業(yè)、栽植面積和產(chǎn)量均具全球首位[2]。桃的適應(yīng)性和抗逆性較強(qiáng)，花色美，果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，富含維生素、糖類和蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，可直接鮮食，還可以加工成桃干、桃果醬、桃罐頭及桃果汁等產(chǎn)品，開發(fā)利用價(jià)值巨大。目前，我國(guó)栽培的桃種質(zhì)主要以‘黃金蜜1’、‘黃金蜜13’、‘中桃6’、‘中桃9’和‘中桃13’等10 幾個(gè)品種為主[3]，但由于其悠久的栽培歷史和混亂的引種馴化，使我國(guó)桃種質(zhì)出現(xiàn)了很多“同名異物”和“同物異名”；并且桃品種間樹形、葉片、花器官、果實(shí)等的形態(tài)特征相似，使得傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類法難以準(zhǔn)確鑒定桃主栽品種，這嚴(yán)重地影響了跨地區(qū)間桃品種的引種效率，也給桃種質(zhì)的栽培管理帶來了很多不確定性[4-5]。隨著分子生物學(xué)和生物信息技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于物種鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化、種群遺傳學(xué)和分子輔助育種等研究領(lǐng)域。其中，SSR（Simple sequence repeat）分子標(biāo)記，又稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、通用性強(qiáng)和共顯性遺傳標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，在桃屬及其近緣物種的分子研究中應(yīng)用最為廣泛[6-8]，但目前利用SSR 分子標(biāo)記對(duì)桃主栽品種開展種質(zhì)鑒定和指紋圖譜構(gòu)建的相關(guān)研究較少。本研究利用多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的15 個(gè)SSR 分子標(biāo)記，對(duì)國(guó)內(nèi)外26 個(gè)桃主栽品種進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)，開展桃主栽品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，對(duì)其進(jìn)行品種鑒別和SSR分子指紋圖譜構(gòu)建，為國(guó)內(nèi)桃品種的鑒別，以及準(zhǔn)確引種和精準(zhǔn)栽培管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試研究材料采集于2018年6月，分別采自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院苗圃、內(nèi)蒙古林業(yè)科學(xué)研究院苗圃、中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心桃基因庫(kù)和內(nèi)蒙古良種繁育中心桃種質(zhì)資源圃，包括國(guó)內(nèi)外主栽的桃品種26 個(gè)（表1），其中國(guó)內(nèi)品種15 個(gè)，國(guó)外品種11 個(gè)。隨機(jī)選取生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的單株，采集嫩葉，液氮速凍帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃下的超低溫冰箱，以備提取基因組DNA。

表1 供試桃品種及來源Table 1 Origins and cultivars of peach in the study

1.2 桃品種基因組DNA 的提取

采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（DP350，天根生化科技（北京）有限公司）提取供試26 個(gè)桃主栽品種的基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA 的含量及純度，并將其濃度調(diào)至50 ng/μL，保存于-80℃下的超低溫冰箱，以備PCR 反應(yīng)擴(kuò)增。

1.3 SSR 引物的篩選及PCR 反應(yīng)

參考近期發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，初步選取開發(fā)自桃及其近緣種的48 對(duì)SSR 引物供篩選，最終篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)且重復(fù)性好的15 對(duì)SSR 引物，詳細(xì)信息見表2。

表2 本研究所用的SSR 引物信息Table 2 Information of SSR primers used in the study

SSR 引物的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，內(nèi)含1 μL 目標(biāo)物DNA 模板（20 ng/μL），1 μL 帶熒光標(biāo)記（NET、FAM、VIC 或PET）的SSR 正向引物，1 μL SSR 反向引物，12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix，9.5 μL 無菌去離子水（ddH2O）。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃的預(yù)變性5 min；94℃的變性30 s，54～55℃退火35 s，72℃延伸45 s，設(shè)置30 次循環(huán)，72℃終延伸5 min 后置于4℃保存。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)DNA 純化試劑盒純化后用ABI 3500XL（Applied Biosystems，USA）遺傳分析儀檢測(cè)其條帶峰度，利用Gene-Marker 軟件讀取每個(gè)SSR 位點(diǎn)的片段大小。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用GenAlEx 6.501 軟件[12]分析各SSR 位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）；基于Arlequin v 3.1 軟件[13]計(jì)算各SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）。用Excel 軟件構(gòu)建26 個(gè)桃主栽品種的SSR 分子指紋圖譜。桃主栽品種的聚類分析是根據(jù)各品種間的Nei’s 遺傳相似系數(shù)，由NTSYS PC version 2.10e 軟件的UPGMA 法完成[12-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃主栽品種的遺傳多樣性

根據(jù)48 對(duì)SSR 引物在桃主栽品種的毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)中的初步結(jié)果，篩選出多態(tài)性高、重復(fù)性強(qiáng)、無雜帶的15 對(duì)SSR 引物，用于后續(xù)26 個(gè)桃主栽品種的遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構(gòu)建（表3）。

表3 26 個(gè)桃主栽品種在15 個(gè)SSR 位點(diǎn)的遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of 15 SSR markers in 26 cultivars of peach

由表3可知，供試桃主栽品種在所篩選的15個(gè)SSR 位點(diǎn)上的多態(tài)性較高，15 對(duì)SSR 引物在26 個(gè)桃主栽品種中共檢測(cè)到259 個(gè)等位基因（Na）和213.41 個(gè)有效等位基因（Ne），每個(gè)SSR 位點(diǎn)的平均Na和Ne分別為17.27 個(gè)和14.23 個(gè)；其中，位點(diǎn)BPPCT-025 上檢測(cè)到的Na和Ne最多，分別為23 個(gè)和20.94 個(gè)，而位點(diǎn)pchgms-54 和UDP97-402 上的Na（12 和12 個(gè)）和Ne（10.31 和10.04 個(gè)）最少；15 個(gè)SSR 位點(diǎn)的期望雜合度（He）介于0.24～0.63之間，觀察雜合度（Ho）介于0.29～0.79之間，其平均值分別為0.43 和0.54，表明目前桃主栽品種的遺傳多樣性水平適中。15 個(gè)SSR 位點(diǎn)的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）在0.75～0.91 間，其值均大于0.50，表明所選SSR 引物多態(tài)性較高，適用于供試桃主栽品種的物種鑒定、種群遺傳學(xué)等相關(guān)分析。

2.2 桃主栽品種的SSR 指紋圖譜

根據(jù)供試桃主栽品種在15 個(gè)SSR 位點(diǎn)上的毛細(xì)管熒光電泳檢測(cè)條帶大小，構(gòu)建了26 個(gè)桃主栽品種的SSR 指紋圖譜（圖1）。由圖1可知，單獨(dú)的一個(gè)SSR 引物無法將供試26 個(gè)桃主栽品種鑒別開，只能將26 個(gè)桃主栽品種區(qū)分為4～11 組。其中，引物pchgms25 的鑒別能力最強(qiáng)，能鑒別‘天仙紅’、‘慶豐’、‘沙紅桃’、‘砂子早生’、‘松森’、‘NJN9’、‘春蕾’、‘早春紅’、‘中油9’和‘加納巖’等10 個(gè)桃品種，可將供試26個(gè)桃品種分為11 組；而引物UDP98-408 的鑒別能力最低，將供試26個(gè)桃品種分為4組，僅能鑒別‘倉(cāng)方早生’、‘白風(fēng)’和‘黃金蜜13’三個(gè)桃品種；其余引物的鑒別能力適中，如引物BPPCT-017 和UDP96-003 分別能鑒定‘NJN83’、‘NJN9’、‘春蕾’、‘天仙紅’、‘天仙紅’和‘中油13’等6 個(gè)桃品種；引物BPPCT-001 能鑒別‘京玉’、‘松森’、‘加納巖’、‘早春紅’和‘北冰洋之藍(lán)’5個(gè)桃品種。

圖1 基于15 對(duì)SSR 引物的26 個(gè)桃主栽品種的指紋圖譜Fig.1 Fingerprinting key of 26 peach cultivars using the 15 SSR markers

26 個(gè)桃主栽品種在15 個(gè)SSR 位點(diǎn)上的目標(biāo)片段大小在95～416 bp 之間，其中引物pchgms25 單獨(dú)鑒別桃品種的能力最強(qiáng)，若將引物pchgms25 分別與引物PceGA25、UDP96-003、UD98-412-50、UDP98-409、UDP98-406、UDP97-402、Pchgms4-54、BPPCT-001 相結(jié)合則能夠?qū)⒐┰?6 個(gè)桃主栽品種全部鑒別開。

2.3 基于SSR 標(biāo)記的26 個(gè)桃主栽品種的聚類分析

根據(jù)26 個(gè)桃主栽品種在15 個(gè)SSR 位點(diǎn)的等位基因頻率，計(jì)算桃品種間的Nei’s 遺傳相似系數(shù)，并利用NYSYSPC2.1 軟件的UPGMA 法對(duì)供試桃主栽品種進(jìn)行遺傳相似系數(shù)的聚類分析（圖2）。由聚類分析結(jié)果可知，26 個(gè)桃主栽品種間的遺傳相似系數(shù)在0.64～0.94 之間，平均遺傳相似度為0.79；其中，品種‘松森’與‘白風(fēng)’的遺傳相似度最高，親緣關(guān)系最近，遺傳相似度為0.94；而品種‘早春紅’與‘加納巖’的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似度為0.64。

圖2 基于SSR 標(biāo)記的26 個(gè)桃主栽品種UPGMA 聚類分析Fig.2 Dendrogram of 26 peach cultivars based on UPGMA of SSR polymorphisms

根據(jù)UPGMA 法的聚類分析結(jié)果可知，在遺傳相似系數(shù)為0.70 時(shí)，可將26 個(gè)桃主栽品種分為3 組，其聚類結(jié)果與品種來源基本一致。第一組包括12 個(gè)桃品種，其中 ‘大久保’、‘京玉’、‘NJN9’和‘慶豐’等品種與由‘NJN83’選育的‘黃金蜜1’、‘中油9’、‘北冰洋之藍(lán)’和‘春蜜’優(yōu)先聚在一起；此外，由‘黃金蜜13’選育出的“中桃6”和‘中油13’再聚在一起，組成第一組群。第二組包括13 個(gè)桃品種，由‘朝暉’選育的優(yōu)良品種‘加納巖’、‘砂子早生’、‘霞暉’、‘松森’、‘白風(fēng)’、‘雨花露’以及‘天仙美’、‘早美’、‘春蕾’、‘布目早生’、‘沙紅桃’和‘倉(cāng)方早生’等品種組成；第三組僅包括‘早春紅’。

3 討 論

本研究利用毛細(xì)管熒光電泳法檢測(cè)SSR 位點(diǎn)片段大小，與常用的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)法相比，具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、通量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前研究物種分類、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域中最常用的方法[14]。SSR 分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可在近緣物種間直接篩選應(yīng)用，本研究利用開發(fā)自桃及其近緣物種的SSR 分子標(biāo)記，結(jié)果表明所選SSR 分子標(biāo)記具有較高的多態(tài)性和通用性，這與Sanchez-Perez 等[15]和包文泉等[10]的研究結(jié)果一致，桃、櫻桃、扁桃和杏等薔薇科樹種間的SSR 分子標(biāo)記具有極高的通用性和穩(wěn)定性，后期直接選擇桃、杏、梅、扁桃的基因組序列，開發(fā)SSR 分子標(biāo)記，用于桃屬、杏屬以及其他近緣物種的相關(guān)研究，可節(jié)省從頭開發(fā)SSR 分子標(biāo)記的經(jīng)費(fèi)和人力。

等位基因數(shù)量是衡量SSR 分子標(biāo)記多態(tài)性高低和應(yīng)用范圍的重要指標(biāo)，其高低是SSR 分子標(biāo)記開發(fā)和篩選的優(yōu)選條件[16-17]。本研究所用的15個(gè)SSR 位點(diǎn)平均等位基因（Na）和平均效等位基因（Ne）分別為17.27 個(gè)和14.23 個(gè)，說明桃主栽品種的遺傳多樣性及水平適中，這一結(jié)果高于凌士鵬等[18]利用12 對(duì)SSR 引物對(duì)53 份桃品種檢測(cè)到的7.92 個(gè)等位基因，也高于魏姍姍等[19]利用18 對(duì)SSR 引物檢測(cè)95 個(gè)桃品種的結(jié)果（平均每位點(diǎn)的Na為5.17），這可能與本研究所用材料有關(guān)，因?yàn)楸狙芯克锰移贩N中既有國(guó)內(nèi)的品種，也有國(guó)外的品種，并且國(guó)內(nèi)桃品種來自不同地區(qū)的不同品系，因此供試桃品種本身多樣性可能較高；還可能與本研究前期對(duì)SSR 引物進(jìn)行了嚴(yán)格的多態(tài)性篩選有關(guān)，進(jìn)而造成本研究中桃品種的遺傳多樣性較高[10]。

通常分子標(biāo)記的多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）若大于0.50 則說明該標(biāo)記具有較高的多態(tài)性，可直接用于后期相關(guān)分析[12]。本研究所用15 個(gè)SSR標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（PIC）值均大于0.75（0.75～0.91），表明所篩選SSR 標(biāo)記均完全適用于桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。但供試15 個(gè)SSR 標(biāo)記鑒別能力存在較大的差異，并且絕大數(shù)標(biāo)記的鑒別能力有限，其中僅有pchgms25 標(biāo)記能夠鑒別出10 個(gè)不同桃品種，其余14 個(gè)供試SSR 標(biāo)記的鑒別能力均較低，若想將供試26 個(gè)桃主栽品種一一鑒別，至少將利用pchgms25、PceGA25、

UDP96-003、UD98-412-50、UDP98-409、UDP98-406、UDP97-402、Pchgms4-54、BPPCT-001 等9個(gè)SSR 標(biāo)記相結(jié)合，說明目前的桃主栽品種間遺傳距離較近，桃主栽品種的遺傳背景較狹窄。這與本研究中聚類分析得出的26 個(gè)桃主栽品種間的遺傳相似度較高（0.64～0.94）相一致，也與李建輝等[4]和羅慧等[5]的研究結(jié)果一致。這可能與桃種質(zhì)資源悠久的栽培歷史中頻繁地異地引種和馴化有關(guān)[19-20]，也可能與供試品種的選育技術(shù)和育種過程有關(guān)[21-22]。因此，后期在桃種質(zhì)的遺傳改良、種質(zhì)創(chuàng)新及選育良種中應(yīng)注意選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的資源[23-25]，以期提高桃種質(zhì)的遺傳多樣性和育種效率，避免后期可能出現(xiàn)的桃品種遺傳退化[26]。

通過聚類分析可將26 個(gè)桃主栽品種分為3 組，其中，同品系品種優(yōu)先聚為一組，其分組結(jié)果與品種來源基本一致，這與羅慧等[5]及陳傳愛等[7]研究結(jié)果一致。說明不同系列品種間基因交流少，此結(jié)果可為后期桃種質(zhì)的遺傳改良、新品種選育、種質(zhì)創(chuàng)新等研究工作中的育種親本的選擇提供重要依據(jù)，還可為建立桃核心種質(zhì)庫(kù)和資源圃等提供理論依據(jù)。

本研究利用15 個(gè)SSR 分子標(biāo)記對(duì)26 個(gè)桃主栽品種進(jìn)行了品種鑒別和指紋圖譜構(gòu)建，為桃種質(zhì)資源的栽培管理提供了較為精確、高效的鑒別技術(shù)支撐，但除了pchgms25 標(biāo)記外，其余標(biāo)記的鑒別能力有限，要將眾多個(gè)桃品種鑒別所需要的SSR 標(biāo)記數(shù)量較多，工作量較大，所需時(shí)間較長(zhǎng)。因此，后期應(yīng)該加強(qiáng)利用桃基因組序列數(shù)據(jù)的進(jìn)一步挖掘，開展分子生物學(xué)研究，開發(fā)更高效的分子標(biāo)記，如從DNA 序列水平上開發(fā)單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記，為桃品種鑒定提供更高效的技術(shù)和理論支撐。

4 結(jié) 論

本研究通過15 個(gè)SSR 分子標(biāo)記對(duì)26 個(gè)桃主栽品種進(jìn)行了品種鑒別和指紋圖譜構(gòu)建研究，研究結(jié)果表明目前桃主栽品種的遺傳多樣性水平適中，但桃主栽品種的遺傳背景較狹窄，遺傳相似度較高，不同品系間基因交流較少。本研究結(jié)果可為桃種質(zhì)資源的創(chuàng)新、核心種質(zhì)資源庫(kù)的建立以及桃種質(zhì)資源的保護(hù)與利用提供理論與技術(shù)支撐。