丁玲玉 江哲龍 莫麗欽 張珍 吳海鷹 潘月龍

血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A），貝伐珠單抗，在多種腫瘤中顯示了較好的療效［1］。不同的患者從貝伐珠單抗治療獲益與否以及獲益的程度均不一樣，目前有急切的需求來篩選出最有可能獲益的患者。至今均未確定一個在臨床中能應(yīng)用的有預(yù)測療效的標(biāo)志物。未經(jīng)選擇的非鱗非小細(xì)胞肺癌患者，一線化療或后線化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合貝伐珠單抗顯示了更好的療效和更長的生存時間［2-3］。在非小細(xì)胞肺癌開展過一些標(biāo)志物的研究，包括VEGF 配體和受體（VEGFRs）、成纖維生長因子（FGF）等［4-5］。關(guān)于血漿標(biāo)志物的預(yù)測作用不同的研究數(shù)據(jù)大不相同。雖然貝伐珠單抗阻斷了VEGF 通路，但血管生成的錯綜復(fù)雜常導(dǎo)致了耐藥的產(chǎn)生。動物模型顯示腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）是抗VEGF 治療耐藥的一個決定因素［6］。本研究旨在探索在非小細(xì)胞肺癌中，血漿標(biāo)志物和貝伐單抗聯(lián)合化療有效率（ORR）之間的關(guān)系。主要研究終點為ORR 和基線VEGF-A、VEGFR-2 和G-CSF 水平的相關(guān)性。次要研究終點包括無疾病進(jìn)展時間（PFS）和基線血漿標(biāo)志物相關(guān)性，血漿標(biāo)志物的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 研究設(shè)計 該研究是在中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行的一個單臂II 期臨床研究。入組標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性非鱗非小細(xì)胞肺癌患者；年齡＞18 歲；美國東部腫瘤協(xié)作組（ECOG）體能狀態(tài)（PS）評分0～2 分；存在實體腫瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）1.1 版可評估的病灶；充足的血液、肝腎儲備功能。排除標(biāo)準(zhǔn)：組織學(xué)為鱗狀細(xì)胞癌；＞2 級咯血；不能有效控制的高血壓；有癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移。研究方案獲得了中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院的倫理委員會審查、通過。該試驗嚴(yán)格遵從赫爾辛基宣言。所有患者均簽署了書面知情同意書。

1.2 研究方案 符合入組標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行每3 周靜脈注射7.5mg/kg 貝伐單抗，劑量參照AVAPERL 研究［2］。根據(jù)研究者決定，化療方案為每3 周靜脈注射500mg/m2培美曲賽或聯(lián)合75mg/m2順鉑。培美曲賽、順鉑聯(lián)合貝伐單抗最多給予6 周期，獲得緩解或穩(wěn)定的患者繼續(xù)給予培美曲賽聯(lián)合貝伐單抗維持治療，直到疾病進(jìn)展或不可耐受的副作用。

1.3 標(biāo)志物樣本收集 在基線和2 周期治療后，用乙二胺四乙酸（EDTA）管采集5ml 患者外周血標(biāo)本。采血30min 內(nèi)予1000r/min 低溫離心15min。隨后，取上清液（血漿）儲存在-80℃冰箱，在分析前避免凍融。

1.4 標(biāo)志物分析方法 選取VEGF-A、VEGFR-2 和G-CSF 為該研究的候選血漿標(biāo)志物。標(biāo)本送到廣州金域檢驗中心進(jìn)行檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，美國Quantikine 研發(fā)系統(tǒng)試劑盒進(jìn)行檢測。

1.5 療效和安全性評價 在基線及每2 周期治療后進(jìn)行高分辨CT 掃描評價腫瘤大小。采用RECIST 1.1 版緩解評估緩解率。采用國家癌癥研究所不良事件的通用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)（NCI-CTCAE）3.0 版進(jìn)行安全性評價，在每周期治療后以及結(jié)束治療后每月進(jìn)行毒性分級。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 該研究主要研究終點為基線血漿VEGF-A，VEGFR-2 和G-CSF 與ORR 的關(guān)系。次要研究終點包括標(biāo)志物與PFS 的關(guān)系，標(biāo)志物水平動態(tài)變化。在做統(tǒng)計分析時，用樣本的中位濃度二分類為高水平（≥中位值）和低水平（＜中位值）組。然而，外周血中G-CSF 實際檢測水平較低，以標(biāo)準(zhǔn)曲線能檢測出最低水平為界，分為高水平（≥39ng/ml）和低水平（＜39ng/ml）組。血漿標(biāo)志物對ORR 的預(yù)測價值采用SPSS 19 版logistic 回歸進(jìn)行分析。Cox 比例風(fēng)險模型則用來分析血漿標(biāo)志物和PFS 之間的關(guān)系。2 周期治療后和基線標(biāo)志物水平的動態(tài)變化采用配對樣本T檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 患者特征 自2016 年11 月至2017 年12 月入組了45 例患者，提供了基線血漿標(biāo)本。37 例患者提供2周期治療后的血漿標(biāo)本。截止2018 年3 月25 日數(shù)據(jù)凍結(jié)。19 例未經(jīng)治患者予培美曲賽/順鉑聯(lián)合貝伐單抗治療；26 例經(jīng)治患者予培美曲賽聯(lián)合貝伐單抗治療。患者基線特征見表1。

2.2 基線血漿標(biāo)志物和ORR 的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)基線低水平G-CSF 比高水平的患者有效率更高；基線高水平VEGF-A 比低水平的患者傾向于更高的有效率；VEGFR-2 的水平高低與有效率無顯著相關(guān)性（見表2）。

表1 基線特征

2.3 基線血漿標(biāo)志物和PFS 的關(guān)系 三個基線血漿標(biāo)志物均不能預(yù)測PFS 的長短。表3 總結(jié)了基線血漿標(biāo)志物低水平和高水平組患者的PFS、HR 和P 值。

表3 基線血漿標(biāo)志物和PFS的關(guān)系

2.4 血漿標(biāo)志物的動態(tài)變化 患者在2 周期治療后的血漿VEGF-A 水平比基線有顯著升高（見表4）。

表4 血漿標(biāo)志物動態(tài)變化

2.5 療效 41 例患者可評價有效率，有效率為31.7%，在一線治療亞組為35.3%，既往經(jīng)治亞組為29.2%。ITT 人群的PFS為4.97個月（95%CI，3.38～6.56）。一線治療亞組PFS 為5.21 個月，既往經(jīng)治亞組的PFS為4.63 個月。截止分析時，有6 例患者仍在接受方案治療，其中4 例患者給予培美曲塞單藥。

2.6 安全性 45 例患者全部納入安全分析。39 例患者（86.7%）經(jīng)歷了＞1 級的不良反應(yīng)（AE），最常見的AE 為1/2 級。最多見的血液學(xué)AE 是白細(xì)胞下降，有14 例患者（31.1%）發(fā)生了白細(xì)胞下降，其中5 例為3/4 級。最多見的非血液學(xué)AE 是疲勞，16 例患者（35.6%）發(fā)生了疲勞，其中4 例為3 級。作者也總結(jié)了貝伐單抗相關(guān)的AE。13 例患者（28.9%）發(fā)生了蛋白尿，其中1 例為3 級。10 例患者（22.2%）發(fā)生了高血壓，其中3 例為3/4 級。10 例患者（22.2%）發(fā)生了鼻出血，其中1 例為3 級。3 例患者因為毒副反應(yīng)停用方案治療。該研究過程中未出現(xiàn)藥物相關(guān)的死亡。

3 討論

本研究探討晚期非鱗非小細(xì)胞肺癌患者中血漿標(biāo)志物和腫瘤緩解率的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)血漿G-CSF 水平和貝伐單抗治療有效率有負(fù)相關(guān)，而血漿VEGF-A水平與貝伐單抗治療有效率有較強(qiáng)的相關(guān)趨勢。

具有更多的腫瘤病灶或者更晚期的腫瘤傾向于具有更高水平的循環(huán)VEGF-A，表明VEGF-A 水平可能反映了腫瘤負(fù)荷。多個研究已經(jīng)證實了血漿VEGF-A在肺癌中的預(yù)后價值［7］。循環(huán)VEGF-A 水平越高可能預(yù)示腫瘤的血管生成越依賴VEGF 通路。在ECOG 4599 研究提示更高水平的VEGF-A 與更高的緩解率相關(guān)［4］。而ABIGAIL 研究則發(fā)現(xiàn)基線低水平VEGF-A和更長的PFS 和總生存相關(guān)，VEGF-A 高水平組患者有效率有更高的趨勢［5］。本研究則表明VEGF-A 高水平組患者傾向于更高的有效率和更長的PFS。血漿VEGF-A 對貝伐單抗療效的預(yù)測研究結(jié)果不一致，可能的原因在于：首先，不同實驗室方法和分析有不同的標(biāo)準(zhǔn)和敏感性；其次，核糖核酸的剪接方式不同，血漿中存在短亞型和長亞型，往往VEGF-A165 水平最高。采用新型酶聯(lián)免疫吸附試驗方法檢測，短亞型比長亞型需要更高的敏感性。最后，不同研究用了不同的抗凝劑處理血標(biāo)本。早期的研究用的檸檬酸鈉抗凝劑，而近期的研究用的是EDTA 抗凝劑。

本研究未發(fā)現(xiàn)VEGFR-2 和療效的相關(guān)性。此結(jié)果與ECOG 4599 研究的標(biāo)志物分析［4］以及ABIGAIL研究結(jié)果一致［5］。雖然VEGFR-2 在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成中扮演了重要的角色［8］。本研究發(fā)現(xiàn)在2 周期貝伐單抗治療后血漿VEGF-A 和VEGFR-2 均有一定程度的升高。循環(huán)中游離的VEGF-A 會與貝伐單抗結(jié)合，難以鑒別游離或結(jié)合的VEGF-A。

腫瘤的血管生成是一個錯綜復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)。而G-CSF 在調(diào)動血液干細(xì)胞、前體細(xì)胞以及成熟細(xì)胞釋放入外周血循環(huán)來刺激腫瘤的血管生成中扮演了重要的角色［9］。G-CSF 是耐藥相關(guān)的旁分泌信號網(wǎng)絡(luò)中的一員，通過核因子κB 和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號來促進(jìn)耐藥的產(chǎn)生［6］。動物模型表明耐藥腫瘤表達(dá)了更高水平的G-CSF。本研究首次在臨床上分析了血漿G-CSF 在抗血管生成治療中的作用。然而本研究發(fā)現(xiàn)部分患者的血漿G-CSF 水平太低以至于檢測不到。本研究發(fā)現(xiàn)血漿G-CSF 低水平的患者相比水平高的患者具有更高的緩解率。說明G-CSF 可能是抗VEGF 治療耐藥的一個決定因素。但未發(fā)現(xiàn)G-CSF 水平與PFS 相關(guān)，可能因為研究入組了初治和經(jīng)治患者，導(dǎo)致了時間終點的復(fù)雜性。

總之，腫瘤血管生成的復(fù)雜性和方法學(xué)的不確定性，導(dǎo)致難以確立預(yù)測貝伐單抗療效的標(biāo)志物。本研究結(jié)果與既往研究類似，未發(fā)現(xiàn)VEGF-A 和VEGFR-2的預(yù)測價值。本研究新穎之處在于從耐藥入手，創(chuàng)新性檢測了G-CSF，分析了G-CSF 和療效的相關(guān)性，初步結(jié)果表明G-CSF 能一定程度上預(yù)測貝伐單抗耐藥，為進(jìn)一步探討預(yù)測貝伐單抗耐藥性生物標(biāo)志物提供了初步基礎(chǔ)和研究方向。