王 璇，徐 斌

南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，南京 220023

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，病變累及包括感覺(jué)神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)及自主神經(jīng)的周圍神經(jīng)系統(tǒng)，其特點(diǎn)是以周圍神經(jīng)由遠(yuǎn)及近逐漸退化，導(dǎo)致感覺(jué)癥狀減退或消失。DPN早期出現(xiàn)較小神經(jīng)病變可致痛覺(jué)異常及感覺(jué)過(guò)敏，后累及較大直徑髓鞘神經(jīng)則出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)及本體感覺(jué)減退[1]。目前DPN的發(fā)病機(jī)制尚未定論，現(xiàn)有研究表明除生活方式改善及嚴(yán)格血糖控制外，尚無(wú)其他有效治療方法，且血糖控制僅可減緩1型糖尿病患者神經(jīng)病變的病程，對(duì)于2型DPN則無(wú)從改善[2]。由糖尿病代謝失衡引起的如血糖、血脂異常及胰島素抵抗可觸發(fā)多元醇、晚期糖基化終產(chǎn)物及己糖胺途徑的激活，導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞及血管細(xì)胞的病理改變，最終致使包括DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)退行性病變的[3]神經(jīng)功能障礙及神經(jīng)病變是當(dāng)前的主要研究方向之一。

現(xiàn)有動(dòng)物模型無(wú)一能準(zhǔn)確反映人類DPN的各方面表征，故近年研究多通過(guò)復(fù)制同源發(fā)病機(jī)制(如飲食誘導(dǎo))或構(gòu)建一致的行為表象(如基因敲除)以建立DPN特異性模型，從而提高具體研究目標(biāo)的可信度。該類模型動(dòng)物與人類疾病發(fā)病機(jī)制及行為表征有一定相似之處，且多數(shù)具藥物治療預(yù)見(jiàn)性，故作為DPN疾病模型具有研究?jī)r(jià)值。而此類方法中動(dòng)物類別、誘導(dǎo)方法、并發(fā)癥持續(xù)時(shí)間、成模指標(biāo)等因素均影響動(dòng)物成模質(zhì)量，進(jìn)而直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，構(gòu)建一種合格有效、標(biāo)準(zhǔn)明確、創(chuàng)建易行的DPN動(dòng)物模型是研究人類DPN疾病的關(guān)鍵。本研究通過(guò)閱讀動(dòng)物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)，對(duì)2型DPN模型常用動(dòng)物、造模方法、成模指標(biāo)、適用指征等進(jìn)行了分析。

資料和方法

文獻(xiàn)來(lái)源及檢索策略檢索PubMed、中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬(wàn)方(Wanfang)等數(shù)據(jù)庫(kù)中2009至2019年間有關(guān)2型DPN動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)，同時(shí)納入研究的參考文獻(xiàn)。中文檢索策略為：2型糖尿病 and 周圍神經(jīng)病變；英文檢索策略為：type 2 diabetes and neuropathy and type 2 diabetic neuropathy。

納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)用動(dòng)物復(fù)制DPN模型；(2)隨機(jī)對(duì)照分組實(shí)驗(yàn)；(3)觀察組造模成功后有明確評(píng)價(jià)指標(biāo)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床試驗(yàn)及研究；(2)研究設(shè)計(jì)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)；(3)重復(fù)發(fā)表文章；(4)與DPN無(wú)關(guān)的文獻(xiàn)；(5)數(shù)據(jù)描述不詳；(6)無(wú)法獲得全文。

數(shù)據(jù)處理將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)分別提取動(dòng)物模型、造模方法、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)等信息建立數(shù)據(jù)庫(kù)，并作圖表進(jìn)行對(duì)比分析。

結(jié) 果

文獻(xiàn)檢索結(jié)果共檢索出526篇文獻(xiàn)，按預(yù)先制定的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)篩選文獻(xiàn)并核對(duì)，最終篩選出中文文獻(xiàn)25篇，英文文獻(xiàn)50篇，共75篇文獻(xiàn)符合要求。

模型建立途徑實(shí)驗(yàn)多選用雄性動(dòng)物，嚙齒類動(dòng)物在模型構(gòu)建中運(yùn)用較多，占所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的98.6%。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑼緩桨蚯贸Ｐ?，如糖尿病脂肪大?ZDF大鼠)、瘦素受體敲除小鼠(db/db小鼠)、瘦素缺乏小鼠(ob/ob小鼠)等；實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型如SD大鼠、Wistar大鼠、C57BL/6小鼠等；飲食誘導(dǎo)模型如DIO大鼠；轉(zhuǎn)基因模型如SDT大鼠、apoE小鼠。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型占比57.3%(圖1)。

模型建立方法基因敲除模型和實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型為實(shí)驗(yàn)多用模型，其中實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型為模擬2型糖尿病發(fā)病過(guò)程而建立的模型，較基因敲除模型病變表型更為明顯，后者如db/db小鼠雖有持續(xù)性高血糖及顯著神經(jīng)病變，但沒(méi)有明顯的熱痛覺(jué)減退或過(guò)敏及表皮內(nèi)神經(jīng)纖維數(shù)量的變化[4]，不利于相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采集。故現(xiàn)實(shí)驗(yàn)多用誘導(dǎo)模型，即高能飲食喂養(yǎng)結(jié)合STZ注射，可較好模擬2型DPN的發(fā)病過(guò)程及癥狀。75篇文獻(xiàn)中，有43篇選用實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型(圖1)。

圖1 2型糖尿病周圍神經(jīng)病變動(dòng)物模型分布

高能飼料配比高能飼料中脂肪類型及含量影響糖尿病的發(fā)展，飽和脂肪(如豬油)較不飽和脂肪(如魚油)更能引起動(dòng)物的胰島素抵抗，故而高能飼料的配比對(duì)于誘導(dǎo)2型糖尿病動(dòng)物模型十分關(guān)鍵。在已公開配比的24例研究中，高脂高糖飼料多采用10%～15%豬油配比，高脂飼料多采用45%～60%的豬油配比(表1)。

表1 高能飼料配比及頻次表

鏈脲佐菌素注射劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)可選擇性破壞動(dòng)物胰島β細(xì)胞，誘發(fā)糖尿病。33例實(shí)驗(yàn)中，小劑量STZ注射(<50 mg/kg)占比84.8%，其中，30～35 mg/kg為常用給藥劑量，占比達(dá)54.6%(表2)。

表2 STZ給藥方法及頻次表

成模檢測(cè)指標(biāo)2型DPN動(dòng)物模型成模檢測(cè)包括2型糖尿病成模檢測(cè)及周圍神經(jīng)病變成模檢測(cè)，前者多以給藥后段時(shí)間內(nèi)血糖值為標(biāo)準(zhǔn)，后者以周圍神經(jīng)癥狀及體征的相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)為依據(jù)。綜合75篇文獻(xiàn)可見(jiàn)血糖檢測(cè)多以7 d后空腹血糖>11.1 mmol/L結(jié)合胰島素抵抗為主要指標(biāo)；周圍神經(jīng)病變成模檢測(cè)多用生理生化指標(biāo)、神經(jīng)電生理檢測(cè)、行為學(xué)檢測(cè)及病理形態(tài)學(xué)檢查，其中單項(xiàng)檢測(cè)以血糖、運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度及機(jī)械痛、熱痛覺(jué)檢測(cè)相結(jié)合為成模檢測(cè)主要指標(biāo)。研究者多采用行為學(xué)檢測(cè)及神經(jīng)電生理檢測(cè)，行為學(xué)以測(cè)定熱痛覺(jué)及機(jī)械痛覺(jué)為主，以潛伏期時(shí)長(zhǎng)作為參考指標(biāo)衡量動(dòng)物模型周圍神經(jīng)病變的發(fā)展情況(表3、4)。

表3 2型糖尿病成模血糖檢測(cè)時(shí)間及頻次表

表4 周圍神經(jīng)病變成模檢測(cè)方法及頻次表

模型特征及適用研究?jī)?nèi)容2型DPN動(dòng)物模型旨在模擬人體DPN發(fā)病特點(diǎn)及癥狀，以便用于研究其發(fā)病機(jī)制、篩選干預(yù)措施，模型建立途徑、成模檢測(cè)方法及模型適用研究統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表5。

表5 2型糖尿病周圍神經(jīng)病變動(dòng)物模型建模方法、成模特征及研究?jī)?nèi)容統(tǒng)計(jì)表

討 論

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)統(tǒng)計(jì)，目前全球近25億人患有DPN，且呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[16- 17]，2型糖尿病患者占比60%～70%[18]，其發(fā)病涉及復(fù)雜而相關(guān)聯(lián)的發(fā)病機(jī)制，包括高糖參與的外周神經(jīng)損傷機(jī)制、血脂紊亂的影響機(jī)制以及代謝性炎癥、神經(jīng)滋養(yǎng)血管病變等[19]，臨床主要表現(xiàn)為由遠(yuǎn)及近的肢體麻木、痛覺(jué)減退，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)障礙，早期相對(duì)可逆，晚期則發(fā)展為頑固性難治性神經(jīng)損傷。為研究其治療方法，探究其發(fā)病機(jī)制，建立一種匹配度高的2型DPN動(dòng)物模型則十分必要。

2型DPN動(dòng)物模型需具備與臨床相似的結(jié)構(gòu)、功能特征，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)型大鼠模型因其成模率高、死亡率低、重復(fù)性強(qiáng)、發(fā)病時(shí)間一致等特點(diǎn)在研究中廣泛采用[20]。該模型多采用高能飲食結(jié)合STZ誘導(dǎo)方法，高能飲食可導(dǎo)致TG及游離脂肪酸在β細(xì)胞內(nèi)堆積，進(jìn)而造成神經(jīng)酰胺增加，并通過(guò)不同途徑激活肌醇需求激酶1等損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡[21]。高能飲食中的脂肪含量及類型均影響糖尿病嚴(yán)重程度[22]。喂食含飽和脂肪(如豬油)的高能飲食更易導(dǎo)致肥胖，數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，高能飼料中10%豬油及20%蔗糖(供能約40～50 kcal)配比運(yùn)用較多，研究證明該配比高能飲食喂養(yǎng)動(dòng)物模型具較高成模率及中度高血糖特點(diǎn)[23]，符合2型糖尿病動(dòng)物模型要求，且45～60 kcal高能飲食喂養(yǎng)嚙齒動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)減慢、行為學(xué)改變(如痛覺(jué)減退)及表皮內(nèi)神經(jīng)纖維數(shù)量減少等周圍神經(jīng)病變表型[24]。

2型糖尿病發(fā)病特點(diǎn)主要為胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能受損[25]。STZ可選擇性破壞胰島β細(xì)胞，注射劑量影響動(dòng)物模型胰島功能。高劑量STZ注射動(dòng)物模型具穩(wěn)定的高血糖，但無(wú)顯著神經(jīng)病變[26]；低劑量STZ注射動(dòng)物模型血糖水平逐漸升高，胰島β細(xì)胞呈進(jìn)行性破壞，符合2型糖尿病特征。篩選文獻(xiàn)中71.4%選用25～35 mg/kg劑量腹腔注射，小劑量STZ注射動(dòng)物模型具成模率高、死亡率低、血糖中度升高、β細(xì)胞胰島素分泌障礙等特點(diǎn)[27]，故為動(dòng)物模型建立多用。

2型DPN動(dòng)物成模指標(biāo)分為2型糖尿病成模檢測(cè)及周圍神經(jīng)病變成模檢測(cè)。高血糖及胰島素抵抗為2型糖尿病主要特征，以實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)型動(dòng)物模型為例，各文獻(xiàn)中確立動(dòng)物糖尿病血糖值標(biāo)準(zhǔn)不一，以給藥7 d后空腹血糖>11.1 mmol/L或給藥后96 h隨機(jī)血糖>13.8 mmol/L多用，結(jié)合指標(biāo)包含體質(zhì)量指數(shù)、胰島素敏感指數(shù)、空腹胰島素等。周圍神經(jīng)病變成模檢測(cè)指標(biāo)包括行為學(xué)檢測(cè)、神經(jīng)電生理檢測(cè)、病理形態(tài)學(xué)檢查及生理生化指標(biāo)檢測(cè)，通常以多種指標(biāo)相結(jié)合判定。

行為學(xué)檢測(cè)為檢測(cè)動(dòng)物模型是否出現(xiàn)疼痛相關(guān)行為，如抑郁傾向、痛覺(jué)遲鈍或過(guò)敏、聲音改變、自殘等。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物模型行為學(xué)檢測(cè)局限于熱痛及機(jī)械痛(占比約90%)，對(duì)厭惡、抑郁等反應(yīng)的測(cè)定僅有2例，因動(dòng)物模型痛覺(jué)測(cè)定會(huì)出現(xiàn)行為依賴，該情況下的測(cè)定結(jié)果不能代表對(duì)刺激的反應(yīng)，故而行為學(xué)測(cè)試需綜合考量。

神經(jīng)電生理學(xué)檢測(cè)主要包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定及動(dòng)作電位振幅測(cè)定，前者通過(guò)測(cè)定有髓神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度以評(píng)定神經(jīng)元及髓鞘的功能狀態(tài)[28]，后者通過(guò)計(jì)算動(dòng)作電位振幅總和評(píng)估軸突損傷程度，兩者綜合評(píng)定神經(jīng)功能障礙程度。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，研究者側(cè)重于測(cè)定運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度(占比約93.5%)，較少測(cè)定神經(jīng)動(dòng)作電位振幅，后者在嚙齒動(dòng)物模型中意義不顯，因動(dòng)作電位振幅受機(jī)體狀態(tài)等多因素影響，臨界閾值與肌肉疲勞程度呈負(fù)相關(guān)，誤差率高達(dá)40%[29]，故不宜納入主要測(cè)量指標(biāo)范疇。神經(jīng)傳導(dǎo)速度主要測(cè)定大直徑有髓纖維的功能狀態(tài)，無(wú)法對(duì)小直徑無(wú)髓纖維損傷程度定性，故需結(jié)合其他指標(biāo)。

病理形態(tài)學(xué)檢查包括病理學(xué)檢查和形態(tài)學(xué)分析，數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)研究者最常用為坐骨神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)定性檢查及表皮神經(jīng)纖維密度定量檢查。坐骨神經(jīng)形態(tài)、髓鞘、軸索等結(jié)構(gòu)均可直接反映神經(jīng)損傷，是周圍神經(jīng)病變最直觀證據(jù)。在DPN動(dòng)物模型中通?？梢?jiàn)坐骨神經(jīng)髓鞘板層結(jié)構(gòu)分離、排列紊亂、軸索變形等特征，干預(yù)后見(jiàn)坐骨神經(jīng)空泡、裂隙減少、髓鞘形態(tài)改善則可說(shuō)明干預(yù)措施有效。表皮神經(jīng)纖維密度多用于量化神經(jīng)損傷程度，皮膚神經(jīng)纖維中90%以上為直徑小于7 μm的小直徑無(wú)髓神經(jīng)纖維和髓鞘稀疏神經(jīng)纖維，在周圍神經(jīng)病變?cè)缙谶€未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀及電生理依據(jù)時(shí)可靈敏反映數(shù)量及形態(tài)異常，準(zhǔn)確率及特異性達(dá)90%，彌補(bǔ)了常規(guī)電生理僅能檢測(cè)大直徑有髓神經(jīng)纖維功能的局限性[30- 31]。

目前不同類別動(dòng)物模型均被證實(shí)無(wú)法完全模擬2型DPN病理表征，各建模方法及研究?jī)?nèi)容均有側(cè)重?；蚯贸Ｐ鸵蚱滹@著的病理形態(tài)學(xué)指征多用于研究DPN中后期病變機(jī)制研究；飲食誘導(dǎo)模型出現(xiàn)肥胖相關(guān)指征，多適用于DPN早期病變及肥胖相關(guān)研究；轉(zhuǎn)基因模型多伴血脂異常表現(xiàn)，并且在模型早期即可出現(xiàn)病理指征，適用于DPN的血脂異常、性別機(jī)制及分子變化特征[32]研究；實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型模擬人DPN發(fā)病機(jī)制，且可被胰島素給藥驗(yàn)證，是目前研究各干預(yù)措施起效途徑多用的模型。

評(píng)價(jià)一個(gè)動(dòng)物模型的良莠需依據(jù)“三性”特征，即發(fā)病機(jī)理同源性、行為表象一致性、藥物治療預(yù)見(jiàn)性，兼?zhèn)鋭?chuàng)建易行性、重現(xiàn)性與經(jīng)濟(jì)性特點(diǎn)[33]。2型DPN動(dòng)物模型中，實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型較基因敲除等模型兼具以上優(yōu)勢(shì)，且模型特征顯著，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低、痛覺(jué)異常、表皮神經(jīng)纖維數(shù)量降低、神經(jīng)及髓鞘軸突直徑縮小、軸突萎縮、髓鞘空泡變化明顯[34]以及胰島素抵抗等病理表征，部分模型可出現(xiàn)血脂異常等肥胖指征，適用于研究肥胖患病率與糖尿病并發(fā)癥發(fā)病率的潛在機(jī)制，為當(dāng)前研究熱點(diǎn)[35]。該模型病理表征較早出現(xiàn)，在STZ注射約9周后(模型約17周齡時(shí))即可出現(xiàn)無(wú)髓鞘神經(jīng)軸突明顯萎縮，而基因敲除模型如db/db小鼠在25周齡時(shí)出現(xiàn)相關(guān)指征。DPN在人體表現(xiàn)為終末感覺(jué)神經(jīng)纖維病變，出現(xiàn)肢體遠(yuǎn)端麻木或過(guò)敏等癥狀，這是由于病變累及小直徑纖維如Aδ及C纖維引起的[36]，此類小直徑纖維為表皮內(nèi)神經(jīng)纖維，是動(dòng)物模型與人體DPN神經(jīng)損傷一致性的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[37]。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型的小直徑無(wú)髓鞘神經(jīng)纖維較大直徑有髓鞘神經(jīng)發(fā)病更早、病變更為明顯[38- 39]，且實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)模型表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度均降低明顯，趨勢(shì)具一致性。

綜上，本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)文獻(xiàn)，總結(jié)當(dāng)前2型DPN動(dòng)物模型建立方法及檢測(cè)指標(biāo)，并根據(jù)多個(gè)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)成模指標(biāo)進(jìn)行逐一分析，綜合各指標(biāo)評(píng)價(jià)動(dòng)物模型成模標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)以實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)建立嚙齒動(dòng)物模型，且喂食含10%豬油及20%蔗糖的高脂高糖飼料或40～50 kcal的高能飼料并結(jié)合低劑量(25～35 mg/kg)注射STZ時(shí)，模型質(zhì)量可達(dá)最優(yōu)。該模型兼?zhèn)鋸?fù)制率、成模率、可操作性及病理同源性，為研究2型DPN發(fā)病機(jī)理及干預(yù)措施起效途徑的優(yōu)質(zhì)模型。