宋 靜，白吉祥，王書(shū)惠，劉倫翠，趙志軒

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 1泌尿外科 2中西醫(yī)結(jié)合·老年病科，黑龍江牡丹江 157011

前列腺癌是泌尿生殖系統(tǒng)好發(fā)的腫瘤之一，近年來(lái)在我國(guó)成為發(fā)病率、病死率升高最快的腫瘤，嚴(yán)重威脅男性健康[1- 2]。因此，尋找療效確切的抗前列腺癌藥物，可能成為提高前列腺癌治愈率的重要研究方向。近年來(lái)，天然藥物及其單體成分在抗腫瘤方面的研究取得很大進(jìn)展。具有多靶點(diǎn)、低毒性、良好療效等的抗腫瘤中藥受到越來(lái)越多的關(guān)注。槲皮素是一種廣泛存在于蔬菜、水果及谷物等植物中的植源性黃酮類化合物，也存在于多種中草藥中，如款冬花、三七、高良姜、銀杏等。研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，抗血小板聚集和抗氧化等藥理作用[3]。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)槲皮素具有較強(qiáng)的腫瘤預(yù)防及治療作用，如宮頸癌、胰腺癌、直腸癌、胃癌、口腔癌、乳腺癌和肺癌等[4- 10]。也有研究表明，槲皮素可抑制人前列腺癌PC- 3細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[11- 13]。但是，目前關(guān)于槲皮素誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞自噬的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察了槲皮素對(duì)PC- 3細(xì)胞活力、凋亡、自噬及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路的影響，以期為槲皮素抗前列腺癌作用的深入研究和臨床應(yīng)用提供參考。

材料和方法

材料人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C- 3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，復(fù)蘇PC- 3 細(xì)胞，用10% FBS和1%青鏈雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。槲皮素(純度>98.0%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，槲皮素溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，終濃度≤0.01%)配成200 μmol/L母液，-20℃保存，臨用時(shí)以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。FBS、RPMI1640培養(yǎng)基、GFP-LC3和雙抗生素均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，DMSO購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司。CCK- 8檢測(cè)試劑盒和TUNLE凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。3-甲基腺嘌呤(3-MA，自噬抑制劑)、吖啶橙購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，LC3 抗體、Beclin- 1 抗體、PI3K抗體、磷酸化-PI3K(p-PI3K)抗體、Akt抗體、磷酸化-Akt(p-Akt)抗體、mTOR 抗體、磷酸化-mTOR(p-mTOR)抗體及HRP標(biāo)記二抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

CCK- 8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PC- 3細(xì)胞活力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC- 3細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度槲皮素(0、50、100、150、200 μmol/L)于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)分別加入10 μl/孔CCK- 8混勻，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育90 min。酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的OD值。以空白培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組，計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白對(duì)照組)/(OD0 μmol/L槲皮素-OD空白對(duì)照組)×100%。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值。

TUNEL法檢測(cè)PC- 3細(xì)胞凋亡參照CCK- 8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC- 3細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2飽和濕度下過(guò)夜培養(yǎng)。加入不同濃度槲皮素[0(對(duì)照組)、50、100、150、200 μmol/L]，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。嚴(yán)格按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)PC- 3細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光，未凋亡細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。熒光顯微鏡下觀察PC- 3細(xì)胞核熒光變化并計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)：凋亡指數(shù)(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。每個(gè)劑量組隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野(×200)，取平均值。

吖啶橙染色觀察PC- 3細(xì)胞自噬小泡將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC- 3細(xì)胞以4×106個(gè)細(xì)胞/ml密度爬片，綜合CCK- 8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和TUNEL染色結(jié)果，隨機(jī)分為：(1)對(duì)照組：給予0 μmol/L槲皮素；(2)槲皮素組：給予100 μmol/L槲皮素；(3)3-MA組：給予5 mmol/L 3-MA；(4)槲皮素+3-MA組：給予100 μmol/L槲皮素+5 mmol/L 3-MA。37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS漂洗3次后，滴加新配制的1 mg/L吖啶橙染色液，37℃避光孵育15 min，吸去吖啶橙染色液，用PBS漂洗3次。50%甘油封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小泡，每個(gè)劑量組隨機(jī)選取6個(gè)視野。

GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分析觀察PC- 3細(xì)胞自噬小體將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC- 3細(xì)胞以4×106個(gè)細(xì)胞/ml密度爬片，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到50%后，根據(jù)Lipofectamine TM2000說(shuō)明書(shū)將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC- 3細(xì)胞，6～8 h后更換新的培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染后的PC- 3細(xì)胞分組及給藥同“吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)”。37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，置于倒置熒光顯微鏡下觀察酸性的自噬小體，每個(gè)劑量組隨機(jī)選取6個(gè)視野。

Western blot分析檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白和PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路蛋白的表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC- 3細(xì)胞以5×105個(gè)細(xì)胞/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，分別加入0(對(duì)照組)、100、150 μmol/L槲皮素，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3 次；用RIPA細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行裂解，提取總蛋白；4℃16 000×g離心5 min，取上清。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，按4∶1加入Loading Buffer，100℃煮樣5 min；取30 μg蛋白上樣進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳；轉(zhuǎn)印到PVDF上；5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h；一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入相應(yīng)二抗室溫慢搖孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)對(duì)各組條帶進(jìn)行計(jì)值及統(tǒng)計(jì)分析。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用bonforroni多重校正方法進(jìn)行多組間差異的兩兩比較；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

槲皮素抑制PC- 3細(xì)胞活力CCK- 8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著處理濃度增大和處理時(shí)間延長(zhǎng)，槲皮素對(duì)PC- 3細(xì)胞活力的抑制作用明顯增強(qiáng)，且呈一定的濃度-時(shí)間依賴關(guān)系(圖1)。處理24、48、72 h后，槲皮素對(duì)PC- 3細(xì)胞IC50分別為158.6、107.8、79.1 μmol/L。

圖1 槲皮素抑制PC- 3細(xì)胞活力

槲皮素促進(jìn)PC- 3細(xì)胞凋亡TUNEL染色結(jié)果顯示，槲皮素50、100、150、200 μmol/L組的凋亡指數(shù)分別為(7.91±0.84)%、(20.69±2.34)%、(48.74±5.55)%、(62.91±6.69)%，其中，100(t=5.437，P=0.016)、150(t=7.390，P=0.002)、200 μmol/L組(t=7.944，P=0.001)的凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組的(7.26±0.78)%，50 μmol/L組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.559，P=0.605)(圖2)。

A.對(duì)照組；B.槲皮素50 μmol/L；C.槲皮素100 μmol/L；D.槲皮素150 μmol/L；E.槲皮素200 μmol/L

槲皮素增加PC- 3細(xì)胞自噬小泡數(shù)量吖啶橙染色結(jié)果顯示，槲皮素組PC- 3細(xì)胞中的紅色熒光明顯較強(qiáng)；槲皮素+3-MA組PC- 3細(xì)胞中也可見(jiàn)紅色熒光，但是較槲皮素組弱；對(duì)照組和3-MA組PC- 3細(xì)胞中基本未見(jiàn)紅色熒光，幾乎無(wú)自噬小泡(圖3)。

A.對(duì)照組；B.槲皮素組；C.3-MA組；D.槲皮素+3-MA組

槲皮素增加PC- 3細(xì)胞自噬小體形成GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染分析結(jié)果顯示，槲皮素組轉(zhuǎn)染GFP-LC3的PC- 3細(xì)胞中可見(jiàn)綠色點(diǎn)狀自噬小體；槲皮素+3-MA組轉(zhuǎn)染GFP-LC3的PC- 3細(xì)胞中也可見(jiàn)出現(xiàn)綠色點(diǎn)狀的自噬小體，但是較槲皮素組少；對(duì)照組和3-MA組PC- 3細(xì)胞中極少有自噬小體形成(圖4)。

A.對(duì)照組；B.槲皮素組；C.3-MA組；D.槲皮素+3-MA組

槲皮素升高PC- 3細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素組PC- 3細(xì)胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=6.007，P=0.004)和Beclin- 1表達(dá)(t=4.778，P=0.009)均顯著高于對(duì)照組，3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=0.900，P=0.419)和Beclin- 1表達(dá)(t=2.485，P=0.068)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，槲皮素+3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=0.139，P=0.896)和Beclin- 1表達(dá)(t=2.710，P=0.054)與對(duì)照組相比差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-MA組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=5.564，P=0.005)和Beclin- 1表達(dá)(t=6.608，P=0.003)顯著低于槲皮素組，槲皮素+3-MA組PC- 3細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=6.022，P=0.004)和Beclin- 1表達(dá)(t=6.737，P=0.003)也顯著低于槲皮素組(圖6)。

槲皮素通過(guò)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞發(fā)生自噬Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，槲皮素100 μmol/L組PC- 3細(xì)胞的PI3K(t=0.103，P=0.925)、Akt(t=0.241，P=0.821)和mTOR表達(dá)(t=0.206，P=0.847)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-PI3K(t=4.613，P=0.010)、p-Akt(t=4.506，P=0.011)和p-mTOR表達(dá)(t=3.578，P=0.0.023)顯著低于對(duì)照組；槲皮素150 μmol/L組PC- 3細(xì)胞的PI3K(t=0.271，P=0.795)、Akt(t=0.512，P=0.636)和mTOR表達(dá)(t=0.277，P=0.795)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-PI3K(t=5.798，P=0.004)、p-Akt(t=6.071，P=0.004)和p-mTOR表達(dá)(t=4.553，P=0.011)顯著低于對(duì)照組(圖6)。

與對(duì)照組比較，aP<0.01；與槲皮素組比較，bP<0.01

PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；p-PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇3激酶；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶B；mTOR：哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；p-mTOR：磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白；與對(duì)照組比較，aP<0.05，bP<0.01

討 論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有呈濃度-時(shí)間依賴性抑制PC- 3細(xì)胞活力的作用，亦具有明顯誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞凋亡的作用，以上結(jié)果均與以往研究結(jié)果相一致[11-13]。用槲皮素處理PC- 3細(xì)胞24 h后，當(dāng)槲皮素濃度(50、100、150 μmol/L)較低時(shí)，對(duì)PC- 3細(xì)胞未見(jiàn)明顯細(xì)胞毒性作用，而濃度(200 μmol/L)較高時(shí)，PC- 3細(xì)胞活力顯著受到抑制。為了探討槲皮素自身沒(méi)有細(xì)胞毒性的處理濃度對(duì)PC- 3細(xì)胞自噬的影響，綜合TUNEL染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100、150 μmol/L為槲皮素的處理濃度。

自噬是一種將細(xì)胞中需要降解的細(xì)胞器及未折疊的蛋白等在溶酶體內(nèi)分解代謝的生物學(xué)過(guò)程[14]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為自噬是一種重要的細(xì)胞死亡機(jī)制。促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬活性甚至誘導(dǎo)自噬性死亡可以起到抗腫瘤作用[15]。LC3是自噬發(fā)生過(guò)程中非常重要的一個(gè)標(biāo)志性蛋白。前體LC3蛋白合成之后經(jīng)過(guò)加工修飾形成LC3-Ⅰ型蛋白，自噬活化時(shí)LC3-Ⅰ酯化形成LC3-Ⅱ 型蛋白，并定位于自噬泡，因此其水平在一定程度上反映了自噬體的數(shù)量和自噬程度，也常作為自噬發(fā)生的一個(gè)指標(biāo)[16- 17]。而B(niǎo)eclin- 1是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性蛋白，是自噬的直接執(zhí)行者[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有明顯誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞自噬小泡數(shù)量和自噬小體形成的作用及明顯增加PC- 3細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin- 1的表達(dá)量，加入3-MA后自噬小泡數(shù)量和自噬小體形成則明顯減少及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin- 1的表達(dá)水平明顯下降。以上結(jié)果提示，槲皮素可能具有誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞自噬作用。

為闡明槲皮素誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞發(fā)生自噬的可能機(jī)制，本研究對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路中所涉及的一些關(guān)鍵蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在自噬中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，針對(duì)該信號(hào)通路選擇抑制性藥物治療腫瘤已經(jīng)取得較為滿意的效果[19]。PI3K屬于脂類激酶家族，是一種廣泛存在于胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，能被許多細(xì)胞因子受體活化，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中PI3K主要指Ⅰ類PI3K，Ⅰ類PI3K激活絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，之后通過(guò)一系列調(diào)控使mTOR磷酸化，從而抑制自噬[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有明顯抑制PC- 3細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的作用。以上結(jié)果提示，槲皮素可能具有抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的作用。

綜上，本研究結(jié)果顯示，槲皮素可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)PC- 3細(xì)胞發(fā)生自噬。至于是否與其他機(jī)制有關(guān)，如Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)通路，今后將會(huì)做進(jìn)一步探討。