陳思明，朱亞瓊，王月香，羅渝昆

1中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心超聲診斷科，北京 100853 2南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)專業(yè)，天津 300071

創(chuàng)傷性周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNI)是致殘的常見原因，可造成肢體的感覺、功能障礙，不僅降低生活質(zhì)量，危害患者的身心健康，嚴重者甚至?xí)又厣鐣摀?dān)[1]。神經(jīng)電生理檢測對病變部位的識別及神經(jīng)損傷病因的判定具有局限性[2]。高頻超聲評估周圍神經(jīng)損傷越來越受到臨床醫(yī)生的重視，不僅可提供較高的空間分辨率，還可準確定位神經(jīng)病變的部位、回聲及與周圍組織的關(guān)系[3]。然而，常規(guī)高頻超聲檢查因無法評估神經(jīng)內(nèi)及周圍組織的微循環(huán)情況，其臨床應(yīng)用受到限制。文獻報道，神經(jīng)損傷后神經(jīng)內(nèi)微血管斷裂，如若未能及時干預(yù)治療，將持續(xù)損傷神經(jīng)內(nèi)部血液循環(huán)，抑制軸突再生[4]。因此，需要進一步結(jié)合其他檢查方法更為全面地評估神經(jīng)損傷情況。

能量多普勒成像(power Doppler ultrasound，PDUS)技術(shù)是檢測炎性病變血流的常用方法，與彩色多普勒血流顯像相比，不受血流角度的影響，對低速血流的顯示率更高。研究顯示，PDUS在評估類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的活動性方面比臨床實驗室相關(guān)指標的敏感性更高[5]。超聲造影技術(shù)(contrast-enhanced ultrasound，CEUS)可獲得低噪聲的實時諧波圖像，顯示微血管血流。研究發(fā)現(xiàn)，通過CEUS對時間-強度曲線下面積(area under the curve，AUC)檢測，腕管綜合征患者的正中神經(jīng)微血管密度顯著高于正常對照組[6]，腕管近端正中神經(jīng)內(nèi)的血流明顯并持續(xù)增加，直至術(shù)后至少3個月[7]，提示受損神經(jīng)內(nèi)血流灌注情況可能影響預(yù)后的評估。然而，少有研究評估創(chuàng)傷性周圍神經(jīng)損傷在不同時期CEUS的變化。本研究評估了CEUS技術(shù)在創(chuàng)傷性周圍神經(jīng)損傷不同時期的應(yīng)用價值。

材料和方法

實驗動物及分組4～6月齡雄性新西蘭白兔30只，體質(zhì)量2.5～3.0kg，由中國北京隆安實驗動物養(yǎng)殖中心[許可證號：SCXK(Jing)2014- 0003]提供。采用隨機數(shù)字表法將新西蘭白兔隨機分為5組(n=6)：(1)正常對照組(CON組)：僅暴露坐骨神經(jīng)，未擠壓損傷；(2)3-day 組：坐骨神經(jīng)擠壓傷后3d；(3)2-week組：坐骨神經(jīng)擠壓傷后2周；(4)4-week組：坐骨神經(jīng)擠壓傷后4周；(5)8-week 組：坐骨神經(jīng)擠壓傷后8周。本研究獲中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(20130901- 001)。

動物模型建立所有動物均于左側(cè)大腿肌肉注射0.2 ml/kg陸眠寧(中國吉林長春獸醫(yī)研究所)麻醉。將動物左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺，右側(cè)大腿備皮去毛，常規(guī)碘伏消毒、鋪無菌洞巾后，沿大腿中部水平做縱向皮膚切口，鈍性分離并暴露坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)主干中部旁的肌肉組織處，固定細小無菌導(dǎo)管制作的光滑條形標記物，并用持針器鉗夾此處的坐骨神經(jīng)30 s，夾持程度為3扣，共造成1 cm的神經(jīng)擠壓傷。術(shù)后給予抗生素抗感染治療5 d，青霉素80萬U/d。

擠壓傷神經(jīng)常規(guī)超聲及PDUS檢測采用邁瑞(Mindray，Resona 7)超聲診斷設(shè)備，配備頻率為4～15 MHZ的線陣探頭(型號：L11- 3U)。動物置于左側(cè)臥位，右下肢自然伸直。超聲探頭于神經(jīng)橫斷面識別高回聲導(dǎo)管標記物并確定神經(jīng)擠壓傷處，而后探頭旋轉(zhuǎn)90度，縱切面仔細掃查神經(jīng)損傷區(qū)域，觀察坐骨神經(jīng)的連續(xù)性、內(nèi)徑、回聲強度、內(nèi)部及緊鄰周圍組織的細微血流及損傷神經(jīng)與周圍組織的關(guān)系。測量神經(jīng)最厚處，取3次測量的平均值進行統(tǒng)計學(xué)分析，然后快速切換至PDUS模式，采集受損神經(jīng)區(qū)血流灌注情況的相關(guān)靜態(tài)圖像進行分析。

擠壓傷神經(jīng)CEUS檢測采用邁瑞(Mindray，Resona 7)高分辨率超聲造影成像系統(tǒng)，配備頻率為4～15 MHZ的線陣探頭(型號：L11- 3U)。將聲諾維超聲造影劑(SonoVue，Bracco Imaging，Milan，Italy)與5 ml 0.9%氯化鈉水溶液混合均勻，經(jīng)耳緣靜脈團注(0.13 ml/kg)，隨后用2 ml鹽水沖管。采用機器內(nèi)置軟件對動態(tài)儲存60 s的CEUS視頻進行定量分析。將感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)置于坐骨神經(jīng)擠壓傷部位，隨后自動生成時間-強度曲線及組織內(nèi)部血流灌注的相關(guān)參數(shù)。采用AUC反映組織內(nèi)的相對血容量，達峰時間(time to peak，TTP)反映微泡達到最大強度的時間和峰值強度(peak intensity，PI)反映單次造影劑注射時的最大信號強度，以上3個參數(shù)綜合評價神經(jīng)組織的微血流灌注情況。每個視頻定量分析3 次，取各參數(shù)3次測量的平均值進行統(tǒng)計分析。

組織學(xué)評估CEUS評價完成后，過量麻藥處死各組動物(n=4)，獲取損傷部位及其近端和遠端的坐骨神經(jīng)，剝離周圍組織行NF200免疫熒光染色以觀察軸突的再生情況。標本固定于4%多聚甲醛溶液，石蠟包埋，并切取4μm厚的縱向切片。用10%山羊血清室溫封閉1 h后，滴加抗-NF200抗體(1∶200，N5389，Sigma)作為一抗，放于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。次日，倒棄切片上剩余的液體，用PBS浸洗切片3次，每次5 min。然后避光滴加二抗IgG/Alexa 594(1∶200，ab150116，Abcam)，室溫避光孵育2 h。PBS浸洗3次后，用DAPI復(fù)染細胞核。每張切片選取5個隨機視野，采用Image Pro 6.0 軟件(Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA)分析平均光密度值(optical density，OD)。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

常規(guī)超聲評價CON組神經(jīng)內(nèi)徑均勻，神經(jīng)外膜光滑且連續(xù)性完整。擠壓傷區(qū)域神經(jīng)呈低回聲，神經(jīng)外膜的線性回聲連續(xù)性差，與周圍組織分界不清(圖1)。CON組、3-day組、2-week組、4-week組和8-week組的神經(jīng)內(nèi)徑分別為(0.92±0.11)、(1.37±0.23)、(1.71±0.21)、(1.43±0.19)和(1.14±0.15)mm，其中，3-day組(t=3.55，P<0.001)和2-week組(t=4.96，P<0.001)明顯大于CON組，4-week組(t=6.09，P=0.66)和8-week組(t=4.89，P=0.34)與CON組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 擠壓傷坐骨神經(jīng)常規(guī)超聲縱切面圖像(標記處為擠壓傷后神經(jīng)增粗部位)

PDUS評價CON組坐骨神經(jīng)內(nèi)未見明顯血流信號。3-day 組受損神經(jīng)處可見點狀血流信號且分布不對稱，走形紊亂。2-week組神經(jīng)周圍可見極少細小點狀血流信號。4-week組及8-week組受損神經(jīng)處均未見血流信號。

CEUS評價CON組中動脈早期可見造影劑在到達坐骨神經(jīng)時顯示1或多條供血動脈，幾秒鐘后毛細血管網(wǎng)充滿微泡時坐骨神經(jīng)均勻增強；3-day組動脈早期可見造影劑快速在神經(jīng)擠壓處顯影，且增強強度顯著高于CON組；2-week 組、4-week 組和8-week 組坐骨神經(jīng)損傷處動脈早期可見造影劑的增強時間晚于周圍組織，強度均低于CON組(圖2)。

A.CON組；B.3-day組；C.2-week組；D.4-week組；E.8-week組

AUC：CON組、3-day組、2-week組、4-week組和8-week組分別為(1939.67±131.06)%、(2798.45±211.31)%、(1652.69±110.01)%、(1266.24±102.35)%和(907.82±88.17)%，其中，3-day組明顯高于CON組(t=3.76，P<0.001)，2-week組明顯低于3-day組(t=5.12，P=0.007)，8-week組明顯低于4-week組(t=10.68，P=0.043)。

PI：CON組、3-day組、2-week組、4-week組和8-week組分別為(38.40±5.70)%、(45.33±5.27)%、(30.63±3.94)%、(27.05±2.78)%和(21.16±2.04)%，其中，3-day組明顯高于CON組(t=5.21，P<0.001)，2-week組明顯低于3-day組(t=8.25，P<0.001)，8-week組明顯低于4-week組(t=7.52，P<0.001)。

TTP：CON組、3-day組、2-week組、4-week組和8-week組分別為(7.49±1.07)、(5.03±0.89)、(10.18±1.92)、(13.77±2.03)和(15.89±2.41)s，其中，3-day組明顯低于CON組(t=2.04，P<0.001)，2-week組明顯高于3-day組(t=7.03，P=0.009)，4-week組明顯高于2-week組(t=9.10，P<0.001)，8-week組明顯高于4-week組(t=3.77，P<0.001)。

組織學(xué)評價CON組神經(jīng)軸突粗細均勻，排列整齊、規(guī)則。神經(jīng)擠壓傷后軸突斷裂，隨時間變化逐漸出現(xiàn)再生，但軸突再生的速度緩慢。術(shù)后8周，軸突再生仍未能恢復(fù)至正常水平，表現(xiàn)為稀少、排列不均勻的再生軸突(圖3)。CON組、3-day組、2-week組、4-week組和8-week組的中位累積OD值分別為18 784.8(15 904.5，21 103.5)、3876.5(3137.1，4683.0)、7051.6(5941.4，7922.6)、10 150.1(7477.4，11 839.9)和12 035.6(10 566.3，14 805.8)，其中，2-week組與3-day組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=13.52，P=0.2110)；4-week組明顯高于2-week組(H=9.16，P=0.0100)；8-week組明顯高于4-week組(H=7.11，P=0.0090)但明顯低于CON組(H=7.28，P=0.0003)。

紅色：軸突；藍色：細胞核

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)擠壓傷后常規(guī)高頻超聲顯示損傷神經(jīng)早期水腫增厚，隨時間進展，損傷神經(jīng)的內(nèi)徑及內(nèi)部回聲可逐漸恢復(fù)并接近正常對照組，損傷神經(jīng)是神經(jīng)纖維變性、壞死及再生的動態(tài)變化過程，對其無法準確顯示神經(jīng)纖維再生情況，進而難以評估神經(jīng)損傷后的預(yù)后程度。PDUS結(jié)果顯示，盡管其在損傷急性期時敏感度較高，可顯示損傷神經(jīng)內(nèi)部的細微血流信號，但在慢性期及修復(fù)期時則無法清晰顯示。此時，CEUS則突顯其優(yōu)勢，因其無輻射及無腎毒性，且是純血池顯像，故可在神經(jīng)損傷后的任意時期安全、有效、可重復(fù)地評價神經(jīng)內(nèi)部的微循環(huán)，并與組織病理學(xué)對比分析，對神經(jīng)再生程度的預(yù)判起重要作用。因此，常規(guī)超聲及PDUS不足以充分評估神經(jīng)再生，限制了對損傷神經(jīng)內(nèi)微循環(huán)的探索，而CEUS的檢測必不可少。

本研究結(jié)果顯示，CEUS可為周圍神經(jīng)損傷提供有價值的信息。以往有研究應(yīng)用CEUS檢測腕管綜合征患者正中神經(jīng)的微血流灌注變化，結(jié)果顯示，腕管綜合征患者的平均AUC測量值明顯大于對照組，與本研究中受損神經(jīng)處AUC研究結(jié)果表現(xiàn)出相同趨勢。然而，該研究未發(fā)現(xiàn)AUC與電診斷檢測結(jié)果之間有明顯的相關(guān)性[6]。Evans等[8]將臨床前動物研究的超聲造影方案成功應(yīng)用于靈長類動物模型，檢測了正中神經(jīng)內(nèi)的微血流，結(jié)果表明動物肢體在工作階段，正中神經(jīng)微血流灌注增加。然而，少有研究使用CEUS來評估周圍神經(jīng)損傷后微血流灌注的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，坐骨神經(jīng)擠壓損傷后3d時血流灌注增加，文獻表明這是早期反應(yīng)性充血以使神經(jīng)免受缺血損傷，并被認為與降鈣素基因相關(guān)肽的局部表達相關(guān)[9-10]。隨著時間推移，神經(jīng)內(nèi)血流灌注逐漸減少，推測可能與再生微血管數(shù)量減少有關(guān)。微血管再生數(shù)量減少可能又與神經(jīng)的急性壓迫造成血管機械性損傷，引起持續(xù)的神經(jīng)內(nèi)部微循環(huán)障礙有關(guān)[11-12]。因此，神經(jīng)壓迫解除后出現(xiàn)高灌注或低灌注可能取決于壓迫的嚴重程度和持續(xù)時間。本研究中，鉗夾程度為3扣，可能由于壓迫程度較重導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)及微環(huán)境嚴重受損，支持軸突再生的微血管再生受到抑制。

此外本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后8周時軸突再生仍未能恢復(fù)至正常水平，與正常對照組差異顯著，提示軸突再生緩慢。分析軸突再生緩慢可能與局部的微血流灌注減少有關(guān)[13]。既往研究顯示，微血管為軸突的再生提供營養(yǎng)物質(zhì)并引導(dǎo)軸突的生長方向，當(dāng)微血管受損且新生過程受到抑制時，再生軸突明顯減少[14- 16]，影響神經(jīng)的再生修復(fù)。故損傷神經(jīng)的微血流灌注情況對神經(jīng)后期的修復(fù)起著重要作用[17- 18]。因此，CEUS可彌補常規(guī)超聲及PDUS技術(shù)的不足，進一步對神經(jīng)內(nèi)微血流灌注情況進行監(jiān)測，有助于更為全面評價神經(jīng)修復(fù)再生及指導(dǎo)后期治療。

在臨床中，CEUS對損傷神經(jīng)的微血流灌注情況的評估并不適用于所有人群，例如對于微循環(huán)障礙或糖尿病周圍神經(jīng)病變者，其神經(jīng)周圍的血流會比正常人少；而對于炎癥性病變，如肌炎等，由于肌肉充血其神經(jīng)周圍血流會比正常人豐富[19]。但也有相關(guān)研究顯示，CEUS在兔的糖尿病周圍神經(jīng)病變中可對其坐骨神經(jīng)的微血管病變進行評估。故CEUS對各類疾病的神經(jīng)內(nèi)微血流灌注情況有待進一步研究。

本研究存在以下局限性：(1)未將CEUS參數(shù)結(jié)果與病理的微循環(huán)密度等參數(shù)進行對比研究。(2)研究中樣本量較少，在評估損傷神經(jīng)的微循環(huán)灌注上有待于大樣本的深入研究。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CEUS技術(shù)可在神經(jīng)損傷的任何時期進行微血流灌注的定量評價，從而在神經(jīng)損傷的早期就可發(fā)現(xiàn)并選擇最適合的治療方案，及時有效地改善神經(jīng)內(nèi)微循環(huán)情況，以促使神經(jīng)再生，最大限度恢復(fù)神經(jīng)的功能，為神經(jīng)再生及后期修復(fù)治療的評估提供有價值的信息。