戈 蕾鄒玉安王曉娜

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科,河北張家口 075000;2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北張家口 075000)

腦卒中是臨床常見(jiàn)腦血管疾病,致殘率、致死率高,已成為影響人類生存的重大疾病之一[1]。腦組織對(duì)氧敏感性高,供血供氧不足可引起大量神經(jīng)元死亡,即使及時(shí)恢復(fù)血供仍不可避免,因此,如何積極有效改善腦卒中后神經(jīng)功能的恢復(fù)成為研究重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。頭針療法是根據(jù)中醫(yī)臟腑經(jīng)絡(luò)理論,頭部取穴后進(jìn)行針刺治療各種疾病的療法[3]。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)是用不同頻率磁信號(hào)無(wú)衰減刺激大腦神經(jīng)、外周肌肉等部位從而達(dá)到治療目的的一種方法[4]。近年來(lái),臨床研究證實(shí),頭針療法及rTMS 對(duì)腦卒中后運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等神經(jīng)功能障礙均改善作用,兩者配合應(yīng)用效果確切,但其具體調(diào)控機(jī)制仍不明確[5]。本研究通過(guò)構(gòu)建局灶性腦卒中大鼠模型,評(píng)估頭針療法聯(lián)合rTMS 對(duì)神經(jīng)功能損傷的改善情況,并進(jìn)一步探討其具體調(diào)控機(jī)制,為臨床治療局灶性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 Wistar 大鼠,50 只,8 周齡,體重180～220 g,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(冀)2018-004],動(dòng)物飼養(yǎng)在河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(冀)2018-008],實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物審批(IACUC20170324),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

BCA 蛋白定量分析試劑盒(批號(hào):23227,美國(guó)Thermo 公司);兔抗大鼠蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)單抗、環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine response element binding protein,CREB)單抗、磷酸化 CREB(phosphorylation-CREB,p-CREB)單抗(一抗,批號(hào):ab38949、ab32515、ab32096)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 PKA、CREB、p-CREB IgG 抗體(二抗,批號(hào):ab5815、ab32096、ab25417),(美國(guó)Abcam 公司);LH202H 韓氏治療儀(北京華威有限公司);磁刺激器及圓形線圈(丹麥Dantec 公司);Morris 水迷宮及圖像自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)(基爾頓生物科技(上海)有限公司);電泳儀、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備

參考文獻(xiàn)[6]應(yīng)用線栓法制備局灶性腦卒中模型大鼠:腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉,頸部消毒備皮,暴露頸總動(dòng)脈,微小動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈殘端剪一直徑0.2 mm 小口,并逆向插入尼龍線約18 mm(尼龍線頭部加熱使之為球形),結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端小口,縫合皮膚,尼龍線總長(zhǎng)度約4 cm。缺血2 h 后,輕握大鼠外拉尼龍線,至有阻力感時(shí)提示尼龍線已至頸外動(dòng)脈殘口,恢復(fù)大腦中動(dòng)脈血供,剪斷體表尼龍線;術(shù)后自由飲水、單籠飼養(yǎng)。模型組、頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組大鼠按照上述方法制備模型。術(shù)后24 h 評(píng)估建模情況,0 分:提尾實(shí)驗(yàn)前爪伸直,無(wú)神經(jīng)功能缺陷;1 分:提尾實(shí)驗(yàn)左前肢屈曲;2 分:行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈;3 分:向偏癱側(cè)傾倒;4分:不能行走、意識(shí)昏迷。1 ～3 分大鼠模型制備成功,參與后續(xù)實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組除不插入尼龍線栓外,其余操作同前。

1.3.2 分組及干預(yù)方法

50 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組,各 10 只。模型組 9 只、頭針組 8 只、rTMS 組 8 只、聯(lián)合組 9 只建模成功,術(shù)后24 h 開(kāi)始干預(yù)。頭針組給予頭針療法:大鼠穴位依據(jù)華興邦等[7]編寫的大鼠穴位圖譜進(jìn)行定位,依據(jù)《頭針穴名國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化方案》選穴:頂顳后斜線、頂顳前斜線;采用30 號(hào)一次性無(wú)菌針灸針,進(jìn)針深度約5 mm,進(jìn)針后接通韓氏治療儀(疏密波、頻率2/100 Hz、電流強(qiáng)度2 mA),每次20 min,每天 1 次,共10 d。rTMS 組給予 rTMS:圓形線圈緊貼頭皮固定于大腦右半球,線圈中心位于右耳前約1 cm,設(shè)置磁刺激器刺激頻率0.5 Hz,脈沖刺激強(qiáng)度峰值2T,輸出強(qiáng)度70%,連續(xù)20 次重復(fù)刺激為1 組,每天2 組,共10 d。聯(lián)合組給予頭針療法聯(lián)合rTMS,方法及療程同上,首先給予rTMS,然后進(jìn)行頭針療法,間隔2 h。模型組和假手術(shù)組不做處理。

1.3.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分及行為學(xué)測(cè)試

末次干預(yù)后進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分,評(píng)分方法同前:0 分:提尾實(shí)驗(yàn)前爪伸直,無(wú)神經(jīng)功能缺陷;1 分:提尾實(shí)驗(yàn)左前肢屈曲;2 分:行走時(shí)向左轉(zhuǎn)圈;3 分:向偏癱側(cè)傾倒;4 分:不能行走、意識(shí)昏迷。神經(jīng)功能缺損評(píng)估結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),按照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行操作,實(shí)驗(yàn)包括兩部分,定位巡航實(shí)驗(yàn)(頭針、rTMS 干預(yù)結(jié)束后次日開(kāi)始,連續(xù)5 d)及空間探索實(shí)驗(yàn)(定位巡航實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日,共1 d),記錄定位巡航第5天各組大鼠平均逃避潛伏期,記錄空間探索實(shí)驗(yàn)大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間,兩指標(biāo)反應(yīng)大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。

1.3.4 腦組織標(biāo)本采集及染色

處死各組大鼠,置于生理鹽水冰盤,于顳葉以梗死灶為中心冠狀切腦組織(包括梗死灶周圍皮質(zhì)),切 4 刀共 5 片腦組織,間隔 2 mm 左右。其中每只各取1 片置于2% TTC 中避光染色,孵育30 min(37℃),取出腦片放入10%福爾馬林中避光保存過(guò)夜,拍照觀察梗死灶情況。每只另取1 片置于10%中性甲醛中固定,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,以梗死灶為中心進(jìn)行冠狀位切片,取切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、步驟,進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色,中性樹(shù)膠封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察梗死灶周圍皮質(zhì)組織病理學(xué)改變。

1.3.5 PKA、CREB、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)

取部分梗死灶腦組織(包括梗死灶周圍皮質(zhì)、海馬及側(cè)腦室),液氮中研磨轉(zhuǎn)至離心管,加入0.5 mL 細(xì)胞裂解液,于冰上孵育裂解20 min,12000 r/min 離心15 min,離心半徑12 cm,取離心上清液,進(jìn)行BCA 蛋白定量,取待測(cè)樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,將分離膠置于電轉(zhuǎn)儀上恒定電壓轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后加入封閉液室溫孵育2 h,加入稀釋一抗(1 ∶500),4℃搖床過(guò)夜,PBST 洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5000),室溫繼續(xù)孵育2 h,PBST 再次洗滌3 次后,于暗室中曝光和顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描后,運(yùn)用圖像分析軟件分析各條帶灰度值,相對(duì)表達(dá)量以 PKA、CREB、p-CREB 與 β-actin 灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后,多樣本比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩之間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

假手術(shù)組一般狀況正常,模型組造模期間均出現(xiàn)左前肢癱瘓、蜷臥懶動(dòng)、精神萎靡、消瘦等情況,頭針組和rTMS 組干預(yù)后精神狀態(tài)稍有好轉(zhuǎn),但左前肢仍癱瘓;聯(lián)合組干預(yù)后精神狀態(tài)較頭針組和rTMS 組好轉(zhuǎn),左前肢癱瘓明顯減輕。

2.2 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較

神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=137.246,P＜0.001);與假手術(shù)組比較,模型組、頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分均升高(P＜0.05);與模型組比較,頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分均降低(P＜0.05),且聯(lián)合組低于頭針組、rTMS 組(P＜0.05);頭針組與rTMS 組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表1。

2.3 逃避潛伏期及目標(biāo)象限停留時(shí)間比較

逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與假手術(shù)組比較,模型組、頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組逃避潛伏期均延長(zhǎng),目標(biāo)象限停留時(shí)間均縮短(P＜0.05);與模型組比較,頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組逃避潛伏期均縮短,目標(biāo)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng)(P＜0.05);與頭針組和rTMS組比較,聯(lián)合組逃避潛伏期縮短,目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(P＜0.05);頭針組與rTMS 組逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表2。

2.4 各組腦梗死灶TTC 染色觀察

假手術(shù)組腦組織TTC 染色均勻;模型組缺血側(cè)大腦皮層可見(jiàn)白色梗死灶,并伴有輕度糜爛;頭針組、rTMS 組和聯(lián)合組缺血側(cè)大腦皮層梗死面積縮小,腦組織外觀有所改善,聯(lián)合組改善效果最為明顯,見(jiàn)圖1。

2.5 梗死灶周圍皮質(zhì)病理組織學(xué)觀察

HE 染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常;模型組腦組織結(jié)構(gòu)疏松,呈現(xiàn)篩網(wǎng)狀液化性壞死狀態(tài),神經(jīng)元大量消失,多量小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B);頭針組和rTMS 組腦組織結(jié)構(gòu)破壞輕于模型組,仍可見(jiàn)部分正常神經(jīng)元形態(tài),但部分神經(jīng)元細(xì)胞核周圍細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡化、水腫狀態(tài);聯(lián)合組腦組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元形態(tài)趨于正常,見(jiàn)圖2。

表1 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較( ±s,分)Table 1 Comparison of neurological deficit scores ( ±s,score)

表1 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較( ±s,分)Table 1 Comparison of neurological deficit scores ( ±s,score)

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與頭針組比較,cP＜0.05;與rTMS 組比較,dP＜0.05。Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with scalp group,cP＜0.05.Compared with rTMS group,dP＜0.05.

組別Groups n 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分Neurological deficit score假手術(shù)組Sham operation group 10 0.00±0.00模型組Model group 9 2.52±0.31a頭針組Scalp group 8 2.01±0.20ab rTMS 組 rTMS group 8 2.03±0.21ab聯(lián)合組Combined group 9 1.69±0.20abcd

表2 逃避潛伏期及目標(biāo)象限停留時(shí)間比較( ±s,s)Table 2 Comparison of escape latency and target quadrant stay time

表2 逃避潛伏期及目標(biāo)象限停留時(shí)間比較( ±s,s)Table 2 Comparison of escape latency and target quadrant stay time

注:與假手術(shù)組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與頭針組比較,cP＜0.05;與rTMS 組比較,dP＜0.05。Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with scalp group,cP＜0.05.Compared with rTMS group,dP＜0.05.

組別Groups n 逃避潛伏期Escape latency目標(biāo)象限停留時(shí)間Target quadrant stay time假手術(shù)組 Sham operation group 10 26.59±3.17 45.11±3.69模型組Model group 9 49.88±4.12a 20.56±2.85a頭針組 Scalp group 8 44.30±3.90ab 28.73±2.94ab rTMS 組 rTMS group 8 43.69±3.85ab 29.05±3.07ab聯(lián)合組 Combined group 9 38.21±3.31abcd 33.24±3.12abcd

圖1 各組腦梗死灶TTC 染色觀察Figure 1 General observation of cerebral infarction in each group

圖2 梗死灶周圍皮質(zhì)HE 染色(n=4)Figure 2 HE staining around the infarcted cortex

2.6 腦組織 PKA、CREB、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

腦組織PKA、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);腦組織CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與假手術(shù)組比較,模型組、頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P＜0.05);與模型組比較,頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P＜0.05);聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于頭針組和rTMS 組(P＜0.05),而頭針組與 rTMS 組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)圖3A、3B。

3 討論

近年來(lái)我國(guó)腦卒中發(fā)病率呈升高趨勢(shì),其發(fā)病原因多種多樣,如高血壓、糖尿病、心臟病等多種因素均可引起動(dòng)脈粥樣硬化,進(jìn)而導(dǎo)致腦組織缺血缺氧,神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能喪失,致殘、致死風(fēng)險(xiǎn)高[9-11]。腦組織血供恢復(fù)后的繼發(fā)性損傷,大量自由基、炎癥因子等可繼發(fā)性引起神經(jīng)元死亡,影響神經(jīng)功能的恢復(fù)[12]。因此,及時(shí)減輕腦卒中后繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷,同樣對(duì)疾病的治療及預(yù)后有重要意義。

圖3 腦組織PKA、CREB、p-CREB 蛋白表達(dá)情況(n=4)Figure 3 Expression of PKA,CREB and p-CREB proteins in brain tissue

頭針療法屬中醫(yī)傳統(tǒng)治療腦卒中方法,現(xiàn)代研究證實(shí),頭針療法可通過(guò)促進(jìn)腦組織海馬神經(jīng)元增殖,改善腦卒中后認(rèn)知功能障礙[13]。研究顯示,頭針療法可通過(guò)改善氣虛血瘀證腦卒中患者血液流變學(xué)指標(biāo),進(jìn)而改善患者認(rèn)知功能[14]。本研究中頭針組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分較模型組均升高,逃避潛伏期均縮短,目標(biāo)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng),證實(shí)頭針療法對(duì)腦卒中認(rèn)知神經(jīng)功能的改善作用。既往研究發(fā)現(xiàn),rTMS 可有效增加腦卒中大鼠血流量,進(jìn)一步將該療法用于臨床,取得一定成效[15]。靳靜娜等[16]研究顯示,rTMS 聯(lián)合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可有效激活腦組織靜息態(tài)腦網(wǎng)絡(luò),促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。以上研究說(shuō)明rTMS 對(duì)腦卒中后腦組織活性恢復(fù)具有顯著恢復(fù)作用。本研究中rTMS 組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分較模型組均升高,逃避潛伏期均縮短,目標(biāo)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng),提示rTMS 具有改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能的作用。此外,本研究將頭針療法和rTMS療法聯(lián)合應(yīng)用后,神經(jīng)功能損傷評(píng)分升高、逃避潛伏期均縮短、目標(biāo)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng)現(xiàn)象更為顯著,HE 染色顯示聯(lián)合組腦組織結(jié)構(gòu)破壞最輕,證實(shí)頭針療法聯(lián)合rTMS 對(duì)腦卒中大鼠神經(jīng)功能的改善具有協(xié)同加強(qiáng)作用。

本研究發(fā)現(xiàn),頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白表達(dá)均高于模型組,且聯(lián)合組高于頭針組和rTMS 組,說(shuō)明頭針療法聯(lián)合rTMS 可能通過(guò)激活PKA/CREB 信號(hào)通路發(fā)揮改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能作用。PKA 在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)豐富,既往研究已證實(shí),PKA 是突觸可塑性必須因子,對(duì)長(zhǎng)時(shí)記憶有重要作用[17]。CREB 是位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,可被PKA 磷酸化激活,從而啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄,刺激腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度,參與介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控[18-19]。Teng等[20]研究表明,CREB 磷酸化表達(dá)增強(qiáng)有助于改善缺血性腦損傷大鼠認(rèn)知、記憶能力。屈夏夏等[21]證實(shí),PKA/CREB 信號(hào)通路在改善阿爾茲海默病小鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。上述研究均證實(shí)PKA/CREB 信號(hào)通路在腦神經(jīng)元損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,本研究應(yīng)用頭針組及rTMS 聯(lián)合干預(yù)后PKA/CREB 信號(hào)通路被激活,且大鼠神經(jīng)功能相應(yīng)改善,提示聯(lián)合干預(yù)可能通過(guò)激活該信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述,頭針療法聯(lián)合rTMS 可有效改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能,其作用機(jī)制可能通過(guò)激活PKA/CREB 信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用,為頭針療法聯(lián)合rTMS 應(yīng)用于缺血性腦卒中臨床治療提供理論依據(jù)。