石桂英白 琳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類(lèi)疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)受到廣泛關(guān)注。人們對(duì)干細(xì)胞的了解日漸深入,對(duì)干細(xì)胞的種類(lèi)和功能的探索日益廣泛,從而使干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有遠(yuǎn)大的應(yīng)用前景,同時(shí)為多種重大疾病的治療提供了新的思路和工具[1-3]。由于干細(xì)胞產(chǎn)品種類(lèi)繁多、不同批次差異明顯、細(xì)胞復(fù)雜多變,因此對(duì)應(yīng)用于臨床治療的干細(xì)胞制劑,進(jìn)行質(zhì)量控制尤為重要和關(guān)鍵[4-5]。干細(xì)胞作為活性外源物質(zhì),移植入機(jī)體后,機(jī)體會(huì)對(duì)這種外源刺激產(chǎn)生各種反應(yīng),如釋放細(xì)胞因子、產(chǎn)生免疫反應(yīng)等[6-7]。因此,對(duì)干細(xì)胞的質(zhì)量控制,需要了解干細(xì)胞進(jìn)入機(jī)體后的各種反應(yīng),這就需要應(yīng)用合適的動(dòng)物模型。這種動(dòng)物模型,既要能允許干細(xì)胞植入、分化,機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)又要最大程度與人體相似。普通動(dòng)物有自身的免疫系統(tǒng),對(duì)移植的干細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生排斥反應(yīng),這就影響了干細(xì)胞的植入效率;免疫缺陷動(dòng)物模型,由于自身免疫缺陷不會(huì)排斥移植的外源干細(xì)胞,但是這種動(dòng)物模型不能很好的反映干細(xì)胞進(jìn)入人體的反應(yīng);為了能更好的模擬人體免疫環(huán)境,人們構(gòu)建了人源化小鼠。人源化小鼠是在免疫缺陷小鼠體內(nèi)建立了人的免疫系統(tǒng),因此,干細(xì)胞移植到人源化小鼠后,既保證了移植效率,又能模擬人體的反應(yīng)。因此采用免疫缺陷小鼠和人源化小鼠,可以更好的模擬干細(xì)胞移植后人體免疫反應(yīng),更加準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)干細(xì)胞產(chǎn)品的安全性。因此,本文綜述了免疫缺陷小鼠和人源化小鼠在干細(xì)胞質(zhì)量控制、干細(xì)胞治療評(píng)價(jià)中的應(yīng)用成果,期望通過(guò)對(duì)已有研究的總結(jié)為干細(xì)胞臨床前安全性評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化提供資料和信息。

1 干細(xì)胞的免疫原性

干細(xì)胞種類(lèi)較多,根據(jù)分化能力可分為全能干細(xì)胞,如胚胎干細(xì)胞;多能干細(xì)胞,如造血干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。干細(xì)胞表達(dá)的一些蛋白質(zhì)或者復(fù)合物具有免疫原性[5-8]。如人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)表達(dá)主要組織相容性抗原復(fù)合物Ⅰ類(lèi)分子和ABO 抗原,可激活機(jī)體免疫反[4,6-7];核轉(zhuǎn)移胚胎干細(xì)胞(nuclear transfer embryonic stem cells,NT-ESCs),是將成纖維細(xì)胞的核轉(zhuǎn)入去核的卵母細(xì)胞中,這種細(xì)胞含有卵母細(xì)胞的線粒體抗原,可以激活T 細(xì)胞,產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)[7];誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的免疫原性主要來(lái)自于其表觀遺傳學(xué)改變、蛋白編碼突變和融合蛋白[6-7];間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stromal/stem cells,MSC)表達(dá)人白細(xì)胞抗原Ⅰ類(lèi)分子(human leucocyte antigen,HLA)可以激活免疫應(yīng)答[8]。不同干細(xì)胞的免疫原性見(jiàn)表1。

另外,有些干細(xì)胞,如間充質(zhì)干細(xì)胞,其治療效果主要通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)揮作用,在評(píng)價(jià)其安全性和有效性時(shí),動(dòng)物模型自身的免疫反應(yīng)會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,不能反映干細(xì)胞的真實(shí)作用;應(yīng)用免疫缺陷動(dòng)物能真實(shí)反映干細(xì)胞的作用,而應(yīng)用人源化動(dòng)物,則可以反映人的免疫系統(tǒng)對(duì)干細(xì)胞的應(yīng)答情況,更有利于了解干細(xì)胞植入人體后的機(jī)體反應(yīng)[9]。

2 免疫缺陷小鼠模型

免疫缺陷小鼠是指免疫功能缺陷的小鼠,通常是由先天性遺傳突變導(dǎo)致,或者用人工方法培育而成[10]。根據(jù)免疫細(xì)胞缺失種類(lèi)的不同,可以分為:1.T 淋巴細(xì)胞功能缺陷小鼠:裸小鼠是最早發(fā)現(xiàn)的免疫缺陷小鼠,先天無(wú)胸腺,從而導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞缺失。裸小鼠的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是免疫缺陷動(dòng)物研究和應(yīng)用的起點(diǎn),其在免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域得到普遍應(yīng)用;2.B 淋巴細(xì)胞功能缺陷小鼠:CBA/N 小鼠是X 染色體連鎖的B 細(xì)胞功能缺陷小鼠,可用于研究B 淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生、功能等,在免疫、炎癥及自身免疫疾病的研究中有廣泛應(yīng)用;3.NK細(xì)胞功能缺陷小鼠:Beige 小鼠是NK 細(xì)胞活性缺陷的突變小鼠,用于器官移植等研究;4.聯(lián)合免疫缺陷小鼠:即多種免疫細(xì)胞或功能同時(shí)缺失或缺陷的小鼠,如SCID 小鼠是T、B 細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷小鼠;BNSG 小鼠是 T、B、NK 三聯(lián)免疫缺陷小鼠。

表1 不同干細(xì)胞的免疫原性Table 1 Immunogenicity of different Stem Cells

目前常用的聯(lián)合免疫缺陷小鼠有SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG、NRG 小鼠等。SCID 小鼠是由于Prkdc(protein kinase DNA-activated catalytic)基因突變,導(dǎo)致功能性T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞缺失,但有正常的NK 細(xì)胞,表現(xiàn)為細(xì)胞免疫和體液免疫的重度聯(lián)合免疫缺陷[11]。SCID 小鼠廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。SCID小鼠的缺點(diǎn)是滲漏現(xiàn)象,即少量小鼠在青年期有部分免疫功能恢復(fù),這種滲漏現(xiàn)象不會(huì)遺傳[12]。NOD/SCID 小鼠,即非肥胖性糖尿病免疫缺陷小鼠,是SCID 小鼠與NOD 小鼠即非肥胖性糖尿病小鼠回交獲得的免疫缺陷小鼠[13]。與 SCID 小鼠相比,NOD/SCID 小鼠的NK 細(xì)胞活性低,免疫恢復(fù)幾率更低,各種腫瘤細(xì)胞可移植到NOD/SCID 小鼠體內(nèi),排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病的發(fā)生率更低。NSG 小鼠即 NOD/scid/gamma 小鼠,是在 NOD/SCID 小鼠基礎(chǔ)上敲除了 IL-2 受體 γ 鏈基因[14]。IL-2 受體γ 鏈?zhǔn)嵌喾N細(xì)胞因子的共同受體亞基,這些細(xì)胞因子包括 IL2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21等,它們都具有重要的免疫功能。IL2 受體γ 鏈基因敲除后,小鼠機(jī)體免疫功能降低,特別是NK 細(xì)胞,其活性幾乎喪失,小鼠出現(xiàn)重度免疫缺陷表型,沒(méi)有成熟的T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和功能性NK細(xì)胞,同時(shí)細(xì)胞因子的信號(hào)傳遞能力缺失[15-16]。NSG 小鼠是目前世界上免疫缺陷程度最高的工具小鼠;在多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用,如免疫學(xué)、感染性疾病、干細(xì)胞生物學(xué)等。NRG 小鼠即 NOD/rag/gamma 小鼠,是在NOD 的背景下敲除了Rag1 和IL-2 受體γ 鏈基因,NRG 小鼠對(duì)輻射和基因毒性藥物的耐受性更強(qiáng),更適用于細(xì)胞和組織移植研究[17]。另外在NSG 小鼠基礎(chǔ)上進(jìn)行基因修飾,衍生出多個(gè)免疫缺陷小鼠品系,如NSG B2m、NSG-SGM3 等,這些小鼠在異種移植中更有優(yōu)勢(shì)[18-19]。

3 人源化小鼠模型

人源化小鼠模型是指帶有功能性的人類(lèi)基因、細(xì)胞或組織的小鼠模型[15]。人源化小鼠的構(gòu)建,包含供體細(xì)胞和免疫缺陷小鼠兩個(gè)方面。曾經(jīng)使用的供體細(xì)胞包括人外周血單個(gè)核細(xì)胞、人外周血淋巴細(xì)胞、臍帶血造血干細(xì)胞、動(dòng)員后的成熟造血干細(xì)胞,以及胚胎肝、胸腺組織等?？梢赃x用的免疫缺陷小鼠包括早期使用的裸小鼠,以及后來(lái)發(fā)展起來(lái)的 SCID 小鼠、NOD/SCID 小鼠、NSG 小鼠等。供體細(xì)胞和作為受體的免疫缺陷小鼠都會(huì)影響人源化小鼠的人源化效果,從而影響人源化小鼠的應(yīng)用。

早期構(gòu)建人源化小鼠模型,是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞移植到裸小鼠體內(nèi),由于裸小鼠只是T 淋巴細(xì)胞缺失,而其它免疫細(xì)胞正常,出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng),影響移植效果[11]。隨著科技發(fā)展,人們分離出各種類(lèi)型的造血干細(xì)胞,如臍帶血來(lái)源的造血干細(xì)胞、動(dòng)員后的成熟造血干細(xì)胞等,都成為良好的供體細(xì)胞。同時(shí),人們也培育出新的免疫缺陷小鼠,其免疫缺陷程度更加嚴(yán)重,有利于移植細(xì)胞的存活、分化等。

骨髓-肝-胸腺(bone marrow-liver-thymus,BLT)人源化小鼠是人源免疫系統(tǒng)重建最完善的小鼠模型[20]。構(gòu)建BLT 人源化小鼠,需要對(duì)免疫缺陷小鼠進(jìn)行半致死劑量的照射,將同一個(gè)體來(lái)源的人胚胎肝和胸腺組織塊植入小鼠腎包膜下,再輸入同一個(gè)體的造血干細(xì)胞。BLT 人源化小鼠模型的人源化環(huán)境更強(qiáng),輸入的人造血干細(xì)胞可以分化成多個(gè)細(xì)胞系,包括T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等。BLT 人源化小鼠還建立了人粘膜免疫系統(tǒng)和二級(jí)淋巴組織,并且能產(chǎn)生人源性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答,如生成IgM、IgG 等免疫球蛋白。所以,BLT 人源化小鼠對(duì)植入的外源性組織或細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)更接近人類(lèi)機(jī)體自然反應(yīng)。BLT 人源化小鼠的構(gòu)建和應(yīng)用,促進(jìn)了感染性疾病、腫瘤、再生醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、干細(xì)胞治療等研究領(lǐng)域的發(fā)展[21-25]。

4 免疫缺陷和人源化小鼠模型在干細(xì)胞質(zhì)量控制中的應(yīng)用

目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了多項(xiàng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究[1-4],應(yīng)用免疫缺陷小鼠和人源化小鼠進(jìn)行臨床前研究,對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)研究,評(píng)價(jià)其安全性和有效性。如對(duì)造血干細(xì)胞的相關(guān)研究,了解了造血干祖細(xì)胞在體內(nèi)擴(kuò)增、歸巢、植入及分化機(jī)制[26-28];對(duì)人iPSC 來(lái)源的平滑肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的研究,發(fā)現(xiàn)由于免疫原性抗原的異常表達(dá),兩種分化細(xì)胞的免疫原性不同[29];對(duì)犬iPSC 來(lái)源的MSC[30]、人羊膜上皮細(xì)胞[31]及其來(lái)源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞[32]、人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的胰島素分泌細(xì)胞[33]、胚胎干細(xì)胞來(lái)源的星形膠質(zhì)細(xì)胞[34]等的安全性研究,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞均無(wú)成瘤性和促瘤性;應(yīng)用免疫缺陷小鼠構(gòu)建構(gòu)建疾病模型,評(píng)價(jià)造血干祖細(xì)胞治療的有效性[35];人羊膜上皮細(xì)胞來(lái)源的肝細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)急性肝損傷有治療作用[32];博來(lái)霉素誘導(dǎo)人源化小鼠肺纖維化模型,注射人MSC 可以調(diào)節(jié)T 細(xì)胞紊亂,減輕肺纖維化程度[36];胚胎干細(xì)胞來(lái)源的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)肌萎縮性嵴髓側(cè)索硬化癥有治療效果[34]。綜上可見(jiàn),免疫缺陷小鼠和人源化小鼠在干細(xì)胞質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用,為干細(xì)胞治療的安全性和有效性提供科學(xué)依據(jù)。安全性評(píng)價(jià)包括毒性實(shí)驗(yàn)、致瘤性實(shí)驗(yàn)、促瘤性實(shí)驗(yàn)等。

4.1 毒性實(shí)驗(yàn)

干細(xì)胞制劑中即有干細(xì)胞,又有維持干細(xì)胞活性的支持物質(zhì),而且不同種類(lèi)和不同批次的干細(xì)胞差異較大。因此,有必要對(duì)干細(xì)胞制劑進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)。干細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)可分為急性毒性實(shí)驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)[2]。實(shí)驗(yàn)中,干細(xì)胞植入動(dòng)物體內(nèi)的途徑主要是靜脈注射,包括尾靜脈注射和眼球后靜脈叢注射兩種方式[30,32,37-38],以及治療部位的原位注射[34]。急性毒性實(shí)驗(yàn)通常采用單次或多次大劑量細(xì)胞注射,一般細(xì)胞用量為每千克1×108～2.5×108細(xì)胞,注射細(xì)胞后觀察 4 ～10 周[34,37-39]。長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中注射細(xì)胞的劑量為每千克2.5×106～5×107細(xì)胞體重,注射細(xì)胞后觀察3～4 個(gè)月[31,34,37-39]。觀察及檢測(cè)指標(biāo)包括體重、行為、血常規(guī)、細(xì)胞因子、病理變化等。對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞及CART19 等細(xì)胞的研究中,未發(fā)現(xiàn)明顯的急性或長(zhǎng)期毒性反應(yīng)[31,34,37-39]。

4.2 致瘤性實(shí)驗(yàn)

干細(xì)胞具有自我更新和增殖能力,且其生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制類(lèi)似腫瘤細(xì)胞,已有研究表明,人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可在動(dòng)物體內(nèi)可形成良性或惡性畸胎瘤。干細(xì)胞制劑同樣存在致瘤性的可能,因此,對(duì)于干細(xì)胞制劑有必要檢測(cè)其腫瘤形成能力。已有研究中,干細(xì)胞致瘤性實(shí)驗(yàn),多采用NSG小鼠為受體,在其背部皮下注射干細(xì)胞,細(xì)胞劑量為 5× 104～ 5 × 106細(xì)胞/注射點(diǎn),注射后每天觀察腫瘤形成情況,觀察時(shí)間 20 ～50 周[31,32,34,37-40]。在角質(zhì)形成細(xì)胞、羊膜上皮干細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等致瘤性研究中,均未發(fā)現(xiàn)腫瘤形成[31,32,34,37-40]。

4.3 促瘤性實(shí)驗(yàn)

除了自身形成腫瘤,干細(xì)胞還可以影響體內(nèi)已有腫瘤的生長(zhǎng)增殖,這就是干細(xì)胞的促瘤性。為檢測(cè)干細(xì)胞制劑對(duì)腫瘤生長(zhǎng)是否有影響,可在免疫缺陷小鼠注射腫瘤細(xì)胞系的同時(shí)注射干細(xì)胞,以觀察干細(xì)胞制劑對(duì)腫瘤形成及生長(zhǎng)的作用[31,32,34,37-40]。腫瘤細(xì)胞可用3×106HeLa 或Raji 腫瘤細(xì)胞,干細(xì)胞用量為 5×104～5×106細(xì)胞,注射后每天觀察腫瘤形成情況,觀察時(shí)間20 ～50 周。羊膜上皮細(xì)胞對(duì)腫瘤形成及生長(zhǎng)無(wú)顯著影響[31,32,34,37-40]。

5 展望

在干細(xì)胞制劑的質(zhì)量控制和安全性評(píng)價(jià)中,動(dòng)物模型,尤其是免疫缺陷小鼠模型和人源化小鼠模型發(fā)揮了極大作用。隨著科技的發(fā)展,免疫缺陷小鼠和人源化小鼠品系日益增多,其免疫缺陷程度越來(lái)越高,也能更好地模擬人體對(duì)干細(xì)胞制劑的反應(yīng),這將更有利于各種干細(xì)胞制劑的評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制,從而為干細(xì)胞治療提供科學(xué)依據(jù)。從已有研究看,多種干細(xì)胞都沒(méi)有顯著的毒性、致瘤性、促瘤性等,說(shuō)明干細(xì)胞制劑的安全性是可靠的。但是干細(xì)胞治療的有效性,需要相應(yīng)的疾病動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià),這就需要構(gòu)建出各種疾病動(dòng)物模型,從而為干細(xì)胞治療的有效性提供科學(xué)依據(jù)。