辛靜 辛雅萱 董章宏 瞿紹宏 姚國瓊 李鳳 屈亞亞 唐軍榮

摘要：【目的】分析云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR分布及其序列分布特征，為大量開發(fā)EST-SSR引物及開展火焰蘭屬乃至蘭科植物的SSR遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳育種提供理論依據(jù)。【方法】以云南火焰蘭無菌苗幼嫩葉片為材料，利用高通量測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序，使用Trinity對測序結(jié)果進行de novo組裝，并以MISA對獲得的Unigene進行SSR位點搜索，然后利用Excel 2010對云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率、平均分布距離、基元類型及其重復類型組成等進行統(tǒng)計分析。【結(jié)果】從77888條去冗余的Unigenes序列中搜索到5051個SSR位點，其中有414個屬于復合型SSR位點，實際以4637個SSR位點進行分析，SSR出現(xiàn)頻率為5.95%，平均分布距離13.53 kb。SSR位點中，二核苷酸為主要重復基元類型，數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的52.21%，其次是三核苷酸重復基元，占39.42%，四核苷酸重復基元～六核苷酸重復基元數(shù)量較少。其中，二核苷酸重復基元中的主要重復類型為CT/GA，占SSR總數(shù)的20.64%，三核苷酸重復基元的主要重復類型為CTT/GAA，占SSR總數(shù)的4.70%。SSR基元各重復類型的重復次數(shù)以5～8次居多，占SSR總數(shù)的73.35%，其中，占比最多的是6次重復，占SSR總數(shù)的26.98%，其次是5次和7次，分別占SSR總數(shù)的23.08%和14.02%，且SSR數(shù)量隨各基元重復次數(shù)的增加而降低。云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR基序的平均長度是18.28 bp，其中大小為12～20 bp的SSR基序占SSR總數(shù)的77.49%，21～30 bp基序占SSR總數(shù)的17.88%，大于30 bp的基序占SSR總數(shù)的4.63%，且SSR分布頻率隨基序長度的增加而下降?！窘Y(jié)論】云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組SSR中低級基元類型較豐富，開發(fā)出多態(tài)性高的SSR引物潛力較高，可用于云南火焰蘭乃至火焰蘭屬植物的遺傳多樣性及種質(zhì)資源評價、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳育種等研究。

關(guān)鍵詞： 云南火焰蘭;轉(zhuǎn)錄組;SSR;分布;序列特征;重復基元

中圖分類號： S682.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1634-08

Abstract：【Objective】The analysis of SSR distribution and sequence distribution characteristics in the transcriptome of Renanthera imschootiana Rolfe provided a theoretical basis for the development of? EST-SSR primers， SSR genetic diversity analysis， germplasm resource evaluation， genetic map construction and genetic breeding of Renanthera and even Orchidaceae. 【Method】The young leaves of aseptic R. imschootiana seedlings were used as material to perform transcriptome sequencing by high throughput sequencing. The de novo assembly of the sequencing results was conducted by Trinity， SSR loci search was performed using MISA. Excel 2010 was used to analyze the occurrence frequency， average distribution distance， primitive type and the composition of repetition of SSR in the transcriptome of R.imschootiana. 【Result】A total of 5051 SSR loci were searched from 77888 remove redundant Unigenes sequences， among them， 414 were compound SSR loci， then 4637 SSR loci were used as actual research object. SSR occurrence frequency was 5.95% and avera-ge distribution distance was 13.53 kb. In these SSR loci， dinucleotide repeat units were the main type， accounting for 52.21%， followed by the trinucleotide repeat units（39.42%）. The proportion of tetranucleotide repeat units to hexanucleotide repeat units was low. The main repeat motif types in dinucleotide was CT/GA ， accounting for 20.64% of the total SSR， the main repeat motif types in trinucleotide was CTT/GAA， accounting for 4.70% of the total SSR. The types of SSR repeat units were more of 5-8 repetition times， accounting for 73.35% of the total SSR. The proportion of 6-repetition was the largest with 26.98% proportion of the total SSR， followed by 5-repetition（23.08%） and 7-repetition（14.02%）. As the number of primitive repeats increased， SSR reduced. The average length of SSR sequence motif in the transcriptome of R.imschootiana was 18.28 bp， among them， the SSR sequence motif of 12-20 bp was accounting for 77.49% in the total SSR， the SSR motif of 21-30 bp was accounting for 17.88%， and SSR motif over 30 bp was accounting for 4.63% in the total SSR the distribution frequency of SSR reduced with increasing of motif length. 【Conclusion】The transcriptome SSR of R.imschootiana is rich in low-level primitive types and has a high potential to develop SSR primers with high polymorphism， which can be used to study the genetic diversity and germplasm resources evaluation， genetic map construction and genetic breeding of R.imschootiana and even the Renanthera plants.

Key words： Renanthera imschootiana Rolfe; transcriptome; SSR; distribution; sequence characteristics; repeat primitive

Foundation item： Joint Special Project of Agricultural Basic Research in Yunnan[2017FG001（-019）]

0 引言

【研究意義】云南火焰蘭（Renanthera imschoo-tiana Rolfe）為蘭科（Orchidaceae）火焰蘭屬（Renanthera）附生植物，因其花色紅而艷麗，猶如火焰而得名，主要生長于云南元江縣（吳征鎰和洪德元，1999;中國科學院昆明植物研究所，2003）。野生云南火焰蘭的分布范圍狹窄、數(shù)量極少，且近年來遭到嚴重采挖，致使其野生種質(zhì)資源瀕臨滅絕，現(xiàn)已被列入《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷》的極危（CR）物種和《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》附錄I物種（李娟等，2018）。利用高通量測序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計并分析云南火焰蘭SSR分布及其特征，以期開發(fā)出大量SSR引物，對云南火焰蘭種質(zhì)資源評價、保護利用及遺傳育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，有關(guān)云南火焰蘭的研究報道主要涉及離體快速繁殖（林丹妮等，2006）、種子無菌萌發(fā)和試管育苗（林丹妮等，2008）、雜交育種（曹雯靜等，2014;陳和明等，2019）、種質(zhì)資源評價（姚婧，2015）及種群現(xiàn)狀分析（李娟等，2018）等，而有關(guān)其分子生物學方面的研究鮮見報道。SSR分子標記具有多態(tài)性高、標記數(shù)量多、重復性好、覆蓋面廣等優(yōu)點，已廣泛應用于分子標記輔助選擇、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域（王大瑋等，2018;張金旺等，2018）。根據(jù)SSR的來源可將其分為基因組SSR和EST-SSR兩大類型（程小毛和黃曉霞，2011），前者是利用cDNA文庫構(gòu)建和基因組測序的方法獲得，該方法步驟繁瑣、工作量大且成本高;后者則通過搜索公共數(shù)據(jù)庫中的EST（表達序列標簽）或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行開發(fā)，需要大量EST數(shù)據(jù)支持（趙能等，2017）。葉鵬等（2019a，2019b）先后對藥用植物金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）和云南金花茶（Camellia fascicularis）轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息及序列特征進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者的轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率均較高，基元類型較豐富，重復頻次也較高，從而表現(xiàn)出高的多態(tài)性潛力。此外，研究人員還對云南松（Pinus yunnanensis）（蔡年輝等，2015）、杜仲（Eucommia ulmoides）（申響保等，2016）、四球茶（Camellia tetracocca）（黎瑞源等，2017）、木荷（Schima superba）（林艷等，2018）、牛樟（Cinnamomum kanehirae）（郭鶯等，2018）、芒果（Mangifera indica）（唐玉娟等，2018）、三七（Panax notoginseng）（揭應碧等，2018）和牡丹（賀丹等，2019）等植物進行轉(zhuǎn)錄組SSR位點信息分析，為深入開展植物遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性及分子標記輔助育種提供了前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c】云南火焰蘭在分子水平的研究基礎(chǔ)非常薄弱，至今未見有關(guān)云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組SSR分布及其序列特征的研究報道?！緮M解決的問題】對云南火焰蘭進行轉(zhuǎn)錄組測序，并分析轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量、出現(xiàn)頻率及分布距離等，明確云南火焰蘭高多態(tài)性SSR序列的分布特征，為大量開發(fā)EST-SSR引物及開展火焰蘭屬乃至蘭科植物的SSR遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源評價、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳育種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試云南火焰蘭種植于云南元江縣，采集長勢好且無病蟲害云南火焰蘭母株上的果莢，采用種子無菌萌發(fā)成苗后，取其幼嫩葉片，迅速放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 轉(zhuǎn)錄組測序

將云南火焰蘭幼嫩葉片采用干冰保存后送至廣州基迪奧生物科技有限公司，后續(xù)RNA提取、文庫構(gòu)建及測序工作均由該公司完成，測序平臺為Illumina HiSeqTM 4000。

1. 3 序列拼接及SSR位點搜索

使用Trinity對云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行de novo組裝，并使用MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對轉(zhuǎn)錄組中所有的Unigenes進行SSR位點搜索，參數(shù)設(shè)為二核苷酸重復次數(shù)至少6次，三核苷酸重復次數(shù)至少5次，四核苷酸～六核苷酸重復次數(shù)至少4次。

1. 4 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010對云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率、平均分布距離、基元類型及其重復類型組成等進行統(tǒng)計分析（張震等，2018;楊帥等，2020），相關(guān)計算公式如下：

SSR出現(xiàn)頻率=SSR數(shù)量/Unigene總數(shù)

SSR位點平均分布距離=SSR總序列長度/SSR數(shù)量

2 結(jié)果與分析

2. 1 云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率和分布距離

通過對云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組進行組裝，共獲得77888條去冗余的Unigenes，長度為201～16505 bp，平均長度805 bp，總長度62740868 bp，GC含量42.73%。從中搜索出5051個SSR位點，其中，有414個屬于復合型SSR位點，實際以4637個SSR位點進行分析。SSR出現(xiàn)頻率為5.95%，平均分布距離13.53 kb（表1），即云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中平均13.53 kb就出現(xiàn)1個SSR位點，說明SSR較豐富，為后期SSR引物開發(fā)提供了大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2. 2 云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR基元類型

由表1可知，SSR位點中，二核苷酸為主要重復基元類型，數(shù)量最多，占SSR總數(shù)的52.21%，其次為三核苷酸重復基元，占SSR總數(shù)的39.42%;四核苷酸～六核苷酸重復基元數(shù)量相對較少;在SSR的平均分布距離方面，以五核苷酸重復基元最高，為1206.56 kb，以二核苷酸重復基元最低，僅為25.92 kb;在重復基元類型的出現(xiàn)頻率方面，以二核苷酸重復基元最高，為3.11%;三核苷酸重復基元次之，為2.35%，以五核苷酸重復基元最低，僅占0.07%?？梢?，云南火焰蘭存在較多種類型的SSR基元，是其SSR引物開發(fā)的重要保證。

2. 3 云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR堿基組成及比例

云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中的SSR堿基組成及比例如表2所示。云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組SSR中，二核苷酸～六核苷酸重復基元的重復類型分別有6、30、66、43和105種，共有250種。二核苷酸中重復基元各基序所占比例排序為CT/GA（957個，占SSR總數(shù)的20.64%）>TC/AG（851個，占SSR總數(shù)的18.35%）>AC/TG（241個，占SSR總數(shù)的5.20%）>CA/GT（188個，占SSR總數(shù)的4.05%）>AT/TA（172個，占SSR總數(shù)的3.71%）>CG/GC（12個，占SSR總數(shù)的0.26%），分別占雙堿基重復類型的比例為39.53%、35.15%、9.95%、7.77%、7.10%和0.50%（圖1-A）。三核苷酸重復基元最多的為CTT/GAA（218個），占SSR總數(shù)的4.70%，占三堿基重復類型的11.93%;其次是AAG/TTC（178個），占SSR總數(shù)的3.84%，占三堿基重復類型的9.74%;以ATA/TAT最少（6個），占SSR總數(shù)的0.13%，占三堿基重復類型的0.33%（圖1-B）。四核苷酸重復基元最多的為AAAT/TTTA（20個），占SSR總數(shù)的0.43%，占四堿基重復類型的10.10%（圖1-C）。五核苷酸重復基元最多的是ATGCA/TACGT（2個）和CCCTC/GGGAG（2個），均占SSR總數(shù)的0.04%，占五堿基重復類型的3.85%（圖1-D）。六核苷酸重復基元最多的是CCCTCT/GGGAGA（7個），占SSR總數(shù)的0.15%，占六堿基重復類型的5.07%（圖1-E）。綜上所述，云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組SSR堿基組成中，低級基元類型較豐富，可在該種或該屬植物中檢出較多的遺傳多態(tài)性。

2. 4 云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中各基元重復次數(shù)

SSR基元重復類型的重復次數(shù)以5～8次居多，共計3401個，占SSR總數(shù)的73.35%，其中，占比最多的是6次重復，共計1251個，占SSR總數(shù)的26.98%;其次是5次和7次，分別為1070個和650個，占SSR總數(shù)的23.08%和14.02%。三核苷酸重復基元中重復類型最多的是5次，共993個，且SSR數(shù)量隨各基元重復次數(shù)的增加而降低（圖2）。

2. 5 云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR基序大小

云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中大小為12～20 bp的SSR基序共計3593個，占SSR總數(shù)的77.49%，說明從該轉(zhuǎn)錄組信息開發(fā)出多態(tài)性高的SSR引物潛力較高。21～30 bp基序有829個，占SSR總數(shù)的17.88%;大于30 bp的基序有215個，占SSR總數(shù)的4.63%。SSR基序的平均長度是18.28 bp，二核苷酸～六核苷酸的平均長度分別是18.05、17.84、18.06、21.06和26.91 bp（表1），且SSR的分布頻率隨著基序長度的增加而呈下降趨勢（圖3）。

3 討論

本研究對云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組測序獲得的77888條Unigenes進行SSR位點搜索，共獲得二核苷酸重復基元～六核苷酸重復基元的SSR位點4637個，SSR出現(xiàn)頻率5.95%，平均分布距離13.53 kb。前人研究發(fā)現(xiàn)，從墨蘭（Cymbidium sinense）轉(zhuǎn)錄組測序獲得的51764條Unigenes中搜索到4419個SSR位點（陳起馨，2016）;從金釵石斛（Dendrobium nobile）轉(zhuǎn)錄組測序獲得的207283條Unigenes中搜索到32709個SSR位點（李清等，2017）;從寒蘭（Cymbidium kanran）轉(zhuǎn)錄組測序獲得的68699條Unigenes中搜索到9837個SSR位點（張亞楠等，2017）?？梢?，云南火焰蘭的SSR位點數(shù)量與其親緣關(guān)系較近的物種均存在一定差異。就SSR出現(xiàn)頻率而言，本研究云南火焰蘭SSR出現(xiàn)頻率（5.95%）高于同科的鐵皮石斛（Dendrobium officinale）（5.11%）（肖冬長等，2012），卻低于同科的金釵石斛（15.78%）（李清等，2017）、寒蘭（14.32%）（張亞楠等，2017）和天麻（Gastrodia elata）（8.16%）（周天華等，2017）的SSR出現(xiàn)頻率。但就平均分布距離來看，本研究云南火焰蘭SSR平均分布距離（13.53 kb）高于同科的墨蘭（11.45kb）（陳起馨，2016）、金釵石斛（3.75 kb）（李清等，2017）、寒蘭（6.25 kb）（張亞楠等，2017）和白及（Bletilla striata）（4.35 kb）（陳紅波，2019），與燈盞花（Erigeron breviscapus）（15.32 kb）（陳茵等，2014）和馬尾松（Pinus massoniana）（13.83 kb）（陳曉明等，2018）相當?？梢?，云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率及其分布距離處于中等水平，且不同物種轉(zhuǎn)錄組測序信息存在明顯差異，一方面可能是其本身基因組差異的客觀表現(xiàn);另一方面可能是測序組織器官、轉(zhuǎn)錄組中Unigene數(shù)量和長度、SSR搜索工具及設(shè)定篩選參數(shù)等差異引起（李俊仁等，2018）。

二核苷酸和三核苷酸是多種植物轉(zhuǎn)錄組中SSR的主要基元類型，但各基元類型占比有所差異（李翠婷等，2014;葉鵬等，2019a，2019b）。本研究中SSR以二核苷酸重復基元居多，占SSR總數(shù)的52.21%;其次是三核苷酸重復基元，占39.42%。在云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中，二核苷酸重復基元以CT/GA為主，占SSR總數(shù)的20.64%;三核苷酸重復基元中，以CTT/GAA為主，占SSR總數(shù)的4.70%。這與蝴蝶蘭（Phalaenopsis spp.）（李冬梅等，2011）、石斛（Dendrobium）（邱道壽等，2013）和天麻（周天華等，2017）等植物的重復類型相同，但在杉木（Cunninghamia lanceolata）（文亞峰等，2015）、思茅松（P. kesiya）（趙能等，2017）和金鐵鎖（葉鵬等，2019a）等植物中以三核苷酸重復基元類型數(shù)量最多，其次是其他核苷酸重復基元類型，造成這種差異的原因可能與物種的不同有關(guān)。

SSR多態(tài)性是判斷其有效性的主要依據(jù)，而其主要影響因素是SSR長度（李翠婷等，2014）。研究表明，當SSR長度大于20 bp時多態(tài)性較高，長度為12～20 bp時呈多態(tài)性中等水平，長度小于12 bp時多態(tài)性很低（Temnykh et al.，2001;楊華等，2011）。云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組中，有4422條SSR基序大小主要集中在12～30 bp，占SSR總數(shù)的95.37%，其中，基序大小12～20 bp的SSR有3593條，占SSR總數(shù)的77.49%，呈中等多態(tài)性;長度大于20 bp的基序有1275條，占SSR總數(shù)的27.50%，呈較高多態(tài)性。Gao等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，重復次數(shù)和SSR分子標記多態(tài)性間呈正相關(guān)。Dreisigacker等（2004）研究表明，低級基元SSR多態(tài)性普遍高于高級基元SSR。本研究表明，云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組SSR中低級基元二核苷酸和三核苷酸長度大于20 bp的基序有1022條，占SSR總數(shù)的22.04%，推測云南火焰蘭SSR具有較高的多態(tài)性。因此，該推論可作為潛在的SSR引物序列信息，極大地提高引物設(shè)計和開發(fā)的目的性，為后續(xù)SSR引物的大量開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

云南火焰蘭轉(zhuǎn)錄組SSR中低級基元類型較豐富，開發(fā)出多態(tài)性高的SSR引物潛力較高，可用于云南火焰蘭乃至火焰蘭屬植物的遺傳多樣性及種質(zhì)資源評價、遺傳圖譜構(gòu)建及遺傳育種等研究。

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（責任編輯 陳 燕）