陳子硯 王予涵 劉可可 王月丹**

（1 北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 北京 100871 2 北京大學(xué)附屬中學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)校 北京 100032 3 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100191）

北京時(shí)間10月7日，2019年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)在瑞典卡羅林斯卡大學(xué)醫(yī)學(xué)院揭曉。美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院威廉·凱林（William G.Kaelin Jr.）教授、英國(guó)牛津大學(xué)彼得·拉特克利夫（Peter J.Ratcliffe） 教授和美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院格雷格·塞門(mén)扎（Gregg L.Semenza）教授共同獲得了這一殊榮［1］。

3 位科學(xué)家究竟憑借什么研究成果而獲得了這個(gè)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的頂級(jí)大獎(jiǎng)？這就是對(duì)細(xì)胞在不同氧氣環(huán)境中代謝適應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制的研究和闡釋。細(xì)胞在不同氧氣環(huán)境中代謝適應(yīng)機(jī)制的調(diào)節(jié)，與人們?cè)谏钪械睦诸?lèi)還有幾分相似。

1 人類(lèi)生活在氧氣含量不同的環(huán)境

人類(lèi)生活在這個(gè)世界上，為了維持機(jī)體正常的生理活動(dòng)，需要不停地消耗氧氣，進(jìn)行能量與物質(zhì)的代謝。人可1 周不吃飯，3 天不喝水，但時(shí)刻都離不開(kāi)氧氣。測(cè)量結(jié)果表明，人體在正?？諝猓ㄑ鯕獗壤秊?1%）中，每天需要吸入12 m3的空氣，消耗相當(dāng)于500 L 的氧氣，當(dāng)腦細(xì)胞缺氧超過(guò)6 min 時(shí)，即可因?yàn)槟芰看x障礙而引起不可逆的死亡。當(dāng)人體從氧氣分壓較高的低海拔地區(qū)前往高原地區(qū)時(shí)，有可能發(fā)生以頭痛、頭暈、心慌、氣短、氣急、惡心、嘔吐、乏力、失眠、眼花、嗜睡、手腳麻木、唇指紫紺和心率加快等癥狀為特征的“高原病”。多數(shù)高原病患者可在1 周內(nèi)逐漸恢復(fù)，但少數(shù)患者可能會(huì)病情惡化，發(fā)生高原肺水腫和腦水腫，甚至有致命的風(fēng)險(xiǎn)。

然而，組織中的氧氣也會(huì)在代謝過(guò)程中，產(chǎn)生各種氧自由基等對(duì)細(xì)胞有損傷作用的物質(zhì)，這些自由基可損傷細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體等細(xì)胞器，導(dǎo)致細(xì)胞的損傷、衰老，甚至死亡。研究表明，動(dòng)物吸入純氧后會(huì)出現(xiàn)氧中毒的表現(xiàn)，當(dāng)人類(lèi)進(jìn)入一個(gè)大氣壓的純氧環(huán)境中，超過(guò)24 h 就會(huì)發(fā)生氧中毒型肺炎，最終可能會(huì)因呼吸衰竭而死亡。與高原病相反，人從氧分壓比較低的高原地區(qū)到達(dá)氧分壓較高的平原時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)疲倦、無(wú)力、嗜睡、胸悶、頭暈和腹瀉等癥狀，人也覺(jué)得渾身懶洋洋的，就像喝醉了酒一樣，這被稱(chēng)為“低原反應(yīng)”，俗稱(chēng)“醉氧癥”。

不僅如此，在人體內(nèi)部，不同的組織器官之間也存在著氧氣含量的差異。例如，人體肺泡的氧分壓為104 mmHg，動(dòng)脈血氧分壓為100 mmHg，組織中氧分壓為0 ～30 mmHg，靜脈血氧分壓為40 mmHg。而缺血時(shí)，組織的氧分壓可在原有基礎(chǔ)上進(jìn)一步下降。

當(dāng)發(fā)生冠心病和腦梗塞等血管阻塞性疾病時(shí)，組織內(nèi)的含氧量會(huì)進(jìn)一步下降，細(xì)胞可能會(huì)因缺氧而受損，甚至死亡。另一方面，當(dāng)阻塞的血管復(fù)通后，缺氧組織內(nèi)的氧氣含量急劇增加，又可能造成組織內(nèi)大量自由基產(chǎn)生，以及鈣超載和線(xiàn)粒體損傷等細(xì)胞損傷，也可導(dǎo)致組織細(xì)胞的死亡。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為缺血再灌注損傷。

2 機(jī)體和組織細(xì)胞對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)及其機(jī)制

由于不斷面臨不同含氧的環(huán)境，動(dòng)物機(jī)體和組織細(xì)胞必須不斷對(duì)自身的生理代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，適應(yīng)不斷變化的氧氣環(huán)境。例如，人類(lèi)到了高原后，血液中的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量會(huì)大量增加，提高血液攜帶氧氣的能力，從而在氧氣分壓較低的環(huán)境中，保證人體細(xì)胞代謝所需要的氧氣供應(yīng)。

而當(dāng)血管發(fā)生血栓等阻塞性疾病時(shí)，缺血組織細(xì)胞會(huì)調(diào)節(jié)自身的代謝，降低耗氧量，以適應(yīng)低氧的環(huán)境，而這些組織細(xì)胞周?chē)难芤矔?huì)不斷增生，進(jìn)入缺血組織，甚至形成側(cè)枝循環(huán)，逐漸替代阻塞的血管，滿(mǎn)足缺血組織的氧氣需要。而在阻塞血管復(fù)通之后，組織細(xì)胞又會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)抗和清除自由基的物質(zhì)，并調(diào)整細(xì)胞代謝以適應(yīng)高氧的環(huán)境。

長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直十分關(guān)注機(jī)體和組織細(xì)胞適應(yīng)不同含氧環(huán)境機(jī)制的研究。1957年，Reissman 等采用聯(lián)體畸形的動(dòng)物進(jìn)行缺氧實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)其中一只動(dòng)物處于缺氧環(huán)境中呼吸而另一只動(dòng)物處于正常大氣中呼吸時(shí)，二者體內(nèi)都會(huì)出現(xiàn)同樣的骨髓紅細(xì)胞增生現(xiàn)象。后來(lái)，人們?cè)诖嘶A(chǔ)上分離發(fā)現(xiàn)了缺氧可促進(jìn)腎臟產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素（EPO），拉開(kāi)了對(duì)組織細(xì)胞氧環(huán)境適應(yīng)機(jī)制研究的大幕。

1992年，美國(guó)約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院塞門(mén)扎教授帶領(lǐng)的課題組發(fā)現(xiàn)了缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）及其生理功能［2］。這些發(fā)現(xiàn)，極大推動(dòng)了對(duì)細(xì)胞如何感受氧氣濃度并改變生理代謝功能及其機(jī)制的研究。他們的研究結(jié)果表明，氧氣跟細(xì)胞能量代謝密切相關(guān)，但氧氣對(duì)于細(xì)胞的作用不只限于提供能量代謝，在生物進(jìn)化過(guò)程中形成的很多生理功能其實(shí)都是受到氧氣的作用進(jìn)行調(diào)控的［3］。在塞門(mén)扎教授1995年發(fā)表在PNAS 雜志上的一篇重要相關(guān)文獻(xiàn)中，排名第一的作者是來(lái)自中國(guó)的王廣良先生。在獲悉塞門(mén)扎因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)HIF 而獲得2019年諾貝爾生理學(xué)暨醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)后，王廣良回顧了當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)該分子的艱苦經(jīng)歷。據(jù)他介紹，當(dāng)時(shí)塞門(mén)扎的實(shí)驗(yàn)室正在利用給細(xì)胞培養(yǎng)箱中輸入低濃度氧氣的方法模擬低氧環(huán)境，通過(guò)培養(yǎng)人子宮癌細(xì)胞株Hela 細(xì)胞，尋找該細(xì)胞中能感受氧氣濃度下降而調(diào)控EPO 基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的機(jī)制。在耗時(shí)1年多的研究工作中，他們使用能與活性蛋白結(jié)合的EPO 基因增強(qiáng)子序列制成的親和柱，從幾百升細(xì)胞懸液中最終得到了幾毫克的HIF 蛋白。進(jìn)一步通過(guò)蛋白酶切和測(cè)序，根據(jù)獲得的氨基酸殘基序列，塞門(mén)扎等推測(cè)出HIF的DNA 序列，并制成相應(yīng)的DNA 序列探針，從人類(lèi)基因序列庫(kù)中成功調(diào)取到了HIF 基因的序列（圖1）。從現(xiàn)代生物技術(shù)的角度看，這個(gè)工作絕對(duì)是一個(gè)經(jīng)典的分子克隆故事。

圖1 塞門(mén)扎實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)流程模式圖

在隨后對(duì)于HIF 的結(jié)構(gòu)與功能研究中，人們發(fā)現(xiàn)HIF 家族包括HIF-1、HIF-2 和HIF－3 等多個(gè)成員。其中，HIF-1 和HIF-2 具有一定的同源性，均是由α 和β 2 個(gè)亞基組成的異源二聚體［9］。其中，HIF-1α 和HIF-2α 是主要的氧調(diào)節(jié)原件，它們具有的結(jié)構(gòu)均包括螺旋-套-螺旋（bHLH）區(qū)、PAS 結(jié)構(gòu)域、氧依賴(lài)性降解區(qū)（ODD）和激活區(qū)（TAD）等結(jié)構(gòu)域。在缺氧環(huán)境中，HIF-1α 從細(xì)胞質(zhì)中被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，通過(guò)bHLH 和PAS 結(jié)構(gòu)域與組成性表達(dá)的β 亞基（也稱(chēng)為芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，ARNT）相結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，可分別參與調(diào)節(jié)紅細(xì)胞增殖、新生血管形成、能量代謝和細(xì)胞周期與凋亡等重要生理過(guò)程（圖2）。

圖2 HIF-1α 分子結(jié)構(gòu)模式圖

HIF 主要通過(guò)促進(jìn)EPO 及其受體的表達(dá)和分泌，使骨髓中紅細(xì)胞的生成增加，提高血液攜帶氧氣的能力，緩解組織細(xì)胞的缺氧狀態(tài)。HIF 可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）等與血管和淋巴管生長(zhǎng)相關(guān)的細(xì)胞因子，促進(jìn)缺氧組織中的血管生成，恢復(fù)組織的正常供氧狀態(tài)。HIF 還可誘導(dǎo)腺苷酸激酶3、烯醇化酶1、1，3，3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶1 和2 等能量代謝相關(guān)分子的表達(dá)，從而促進(jìn)糖酵解的過(guò)程，彌補(bǔ)在低氧狀態(tài)下由于呼吸鏈不能正常運(yùn)行而減少的ATP，維持細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的生理活動(dòng)。此外，HIF 還能通過(guò)調(diào)節(jié)P21 和P27等細(xì)胞周期依賴(lài)激酶抑制分子等的表達(dá)及Bcl-2和p53 等凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，參與細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控。一般認(rèn)為，在缺氧狀態(tài)下細(xì)胞阻滯在G1期和細(xì)胞凋亡的發(fā)生，都與HIF 的功能有關(guān)。

3 機(jī)體和組織細(xì)胞在正常氧濃度環(huán)境中對(duì)于HIF 的調(diào)節(jié)及其機(jī)制

HIF 及其功能的發(fā)現(xiàn)，揭示了細(xì)胞在低氧和缺氧環(huán)境中，通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝和改善氧氣供應(yīng)，進(jìn)行適應(yīng)的機(jī)制。但是，在正常氧濃度的環(huán)境中，細(xì)胞又是如何進(jìn)行能量代謝的調(diào)節(jié)和適應(yīng)環(huán)境氧氣濃度的？彼得·拉特克利夫威廉·凱林的研究工作對(duì)這個(gè)過(guò)程和機(jī)制進(jìn)行了揭示。

有趣的是，人們了解細(xì)胞對(duì)正常氧氣濃度環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，首先是從對(duì)一種遺傳性疾病的研究開(kāi)始的。1895年，德國(guó)眼科醫(yī)生馮·希佩爾（Von Hippel）發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜血管母細(xì)胞瘤具有家族性遺傳特征；1926年，瑞典眼科醫(yī)生林島（Lindau）進(jìn)一步觀(guān)察到，視網(wǎng)膜和小腦血管母細(xì)胞瘤不僅是中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管瘤病灶的一部分，而且具有遺傳性；1964年，Melmon 和Rosen 在對(duì)多篇類(lèi)似臨床病例報(bào)告進(jìn)行總結(jié)的基礎(chǔ)上，將中樞神經(jīng)血管母細(xì)胞瘤合并腎臟或胰腺囊腫、嗜鉻細(xì)胞瘤、腎癌及外皮囊腺瘤等疾病，統(tǒng)一命名為“馮·希佩爾-林島綜合征（Von Hippel-Lindau syndrome）”，簡(jiǎn)稱(chēng)VHL 綜合征。研究表明，VHL 綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，其主要原因是定位于人類(lèi)第3 號(hào)染色體短臂的VHL 基因發(fā)生突變所引起的細(xì)胞內(nèi)分子代謝紊亂?？墒?，VHL 基因突變導(dǎo)致神經(jīng)血管瘤發(fā)病增加的具體機(jī)制，一直都在不斷探索之中。

研究發(fā)現(xiàn)，在正常氧氣條件下，在組織細(xì)胞中幾乎不含有HIF-1α。但是，當(dāng)氧氣水平大幅下降之后，細(xì)胞中的HIF-1α 含量會(huì)大量增加，并且進(jìn)入細(xì)胞核，上調(diào)EPO 和其他HIF 相關(guān)基因的表達(dá)，使組織細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境，減少組織細(xì)胞因缺氧而遭受的損傷甚至死亡。其中，威廉·凱林在對(duì)VHL 綜合征的研究中發(fā)現(xiàn)，VHL 基因編碼的VHL蛋白是一種抑癌因子，當(dāng)VHL 基因發(fā)生突變后，就會(huì)產(chǎn)生功能異常的VHL 蛋白，并使細(xì)胞內(nèi)很多受到HIF 調(diào)控的缺氧調(diào)節(jié)分子（例如，血小板衍生生長(zhǎng)因子、VEGF、TGF-α 及EPO 等）大量產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝、血管生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)等許多生理過(guò)程發(fā)生改變，從而使細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)增加。但是，當(dāng)凱林將正常的功能性VHL 基因轉(zhuǎn)入VHL 基因突變的腫瘤細(xì)胞中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α 含量則恢復(fù)正常。后續(xù)的研究表明，VHL 本質(zhì)上是一種泛素連接酶，可將靶蛋白分子泛素化，而被泛素化的蛋白質(zhì)，就會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞蛋白酶體中進(jìn)行降解［4］。因此，VHL 通過(guò)給HIF-1α 打上泛素化的標(biāo)簽，從而調(diào)控后者在細(xì)胞中的降解和代謝，抑制細(xì)胞發(fā)生癌變。

為了揭示氧氣對(duì)于VHL 調(diào)節(jié)HIF-1α 的確切機(jī)制，凱林和拉特克利夫帶領(lǐng)的課題小組分別進(jìn)行了進(jìn)一步的深入研究工作。他們發(fā)現(xiàn)在HIF-1α的分子結(jié)構(gòu)中存在著一個(gè)富含脯氨酸的氧依賴(lài)性降解區(qū)（ODD）。當(dāng)氧氣濃度較高時(shí)，這個(gè)部位的脯氨酸中氫原子經(jīng)常會(huì)與氧氣發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生脯氨酸羥基化，從而具備了被VHL 識(shí)別并結(jié)合的能力，繼而可被泛素化并降解。拉特克利夫還發(fā)現(xiàn)了可催化這個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵酶——脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylases，PHD）［5］。HIF-1α 在PHD 的作用下發(fā)生脯氨酸羥基化修飾，是VHL 識(shí)別并將其泛素化降解的基本條件，但是在缺氧調(diào)節(jié)下，PHD 的活性急劇下降，甚至失活，導(dǎo)致HIF-1α 的羥基化過(guò)程受到抑制，無(wú)法被VHL 識(shí)別和降解，從而啟動(dòng)受到該分子調(diào)控的缺氧相關(guān)因子的表達(dá)，使細(xì)胞發(fā)生適應(yīng)低氧狀態(tài)的能量代謝變化［6］。

圖3 低氧環(huán)境與高氧環(huán)境下VHL 對(duì)HIF-1α 調(diào)節(jié)機(jī)制模式圖

4 利用機(jī)體和組織細(xì)胞氧適應(yīng)調(diào)節(jié)的機(jī)制治療疾病

經(jīng)過(guò)塞門(mén)扎、凱林和拉特克利夫等人的不斷努力，組織細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境氧氣濃度變化的機(jī)制終于被闡明。這對(duì)于人們利用該機(jī)制治療相關(guān)的疾病，具有非常重要的價(jià)值。

首先，VHL 蛋白抑癌作用主要是通過(guò)調(diào)控HIF 的泛素化降解實(shí)現(xiàn)的，而HIF-1α 可調(diào)控人體約5%的基因表達(dá)，這些基因與缺氧下的組織細(xì)胞能量代謝改變或缺氧適應(yīng)有關(guān)，其中大多數(shù)基因也與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)［7］。因此，VHL／HIF-α 通路及其下游調(diào)控基因是研發(fā)腫瘤治療藥物的重要靶點(diǎn)。目前，人們已經(jīng)開(kāi)始借助靶向藥物，例如VEGF 的中和性單克隆抗體（貝伐珠單抗）、針對(duì)VEGF 和PDGF 受體的小分子抑制劑（例如舒尼替尼、索拉非尼和阿西替尼等）及可抑制HIF 轉(zhuǎn)錄的mTOR 酶抑制劑等，阻斷HIF 的致癌作用，用于VHL 綜合癥和腎癌等其他惡性腫瘤的 治 療［8］。

同時(shí)，組織缺氧缺血性疾病也是利用VHL／HIF通路進(jìn)行治療的相關(guān)疾病。例如，冠心病和腦梗塞的患者，在發(fā)生供血不足時(shí)，需要通過(guò)周?chē)艿拇鷥斝栽錾?，最終形成側(cè)枝循環(huán)，從而替代阻塞的血管，恢復(fù)組織細(xì)胞的正常供氧。在此過(guò)程中，可使用VHL 抑制劑（例如VH-298），減少HIF 的降解，增加VEGF 等促進(jìn)新生血管形成的細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而加速緩解組織缺氧的狀態(tài)，減少心肌或腦細(xì)胞的損傷，這對(duì)于緩解病情和促進(jìn)疾病的康復(fù)，都具有非常重要的臨床價(jià)值。

此外，由于VHL/HIF 是調(diào)控EPO 生成的重要調(diào)節(jié)通路，利用該通路治療紅細(xì)胞減少等貧血癥狀，也是非常合理的臨床治療手段。2019年7月，美國(guó)著名的醫(yī)學(xué)期刊The New England Journal of Medicine同時(shí)在線(xiàn)發(fā)表2篇應(yīng)用小分子低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶抑制劑羅沙司，治療慢性腎病透析患者頑固性貧血的III 期臨床試驗(yàn)研究及其結(jié)果，證實(shí)該藥在治療頑固性貧血中具有良好的療效。目前，羅沙司他作為一種作用機(jī)制創(chuàng)新的貧血治療藥物，已分別在中國(guó)和日本獲得批準(zhǔn)上市。

由此可見(jiàn)，對(duì)于VHL／HIF 在細(xì)胞氧環(huán)境適應(yīng)調(diào)節(jié)中的作用及其機(jī)制研究，不僅推動(dòng)了組織細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)研究，而且對(duì)于治療惡性腫瘤、心腦血管疾病和頑固性腎性貧血等重大人類(lèi)疾病，都具有十分重要的臨床價(jià)值，有利于改善這些患者的治療效果及其預(yù)后。因此，凱林、拉特克利夫和塞門(mén)扎等3 人作為揭示組織細(xì)胞氧環(huán)境適應(yīng)分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)者，獲得2019年諾貝爾生理學(xué)暨醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，是當(dāng)之無(wú)愧的。