孫光源 武雪亮 薛軍 張海燕 馬海燕 劉曉寧 韓磊 屈明

[摘要] 目的 探討泛素-1（UBQLN-1）在直腸癌組織中的表達情況、臨床意義及與預后的相關性。 方法 選取2015年12月—2016年1月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院普通外科住院行直腸癌手術患者90例，留取直腸癌灶組織及癌旁正常組織，應用逆轉錄聚合酶鏈反應法（Rt-PCR）檢測UBQLN-1 mRNA在兩組標本中的表達情況，應用免疫組化檢測UBQLN-1蛋白在兩組標本中的表達情況，分析其與腫瘤臨床病理特征的關系。并對所納入的患者進行生存期隨訪，應用Kaplan-Meier繪制生存曲線，應用多因素預后分析UBQLN-1蛋白的表達與直腸癌患者預后的關系。 結果 直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA的相對表達量明顯高于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。直腸癌組織中UBQLN-1的陽性表達明顯高于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。不同分化程度、T分期、淋巴結轉移及肝轉移狀態(tài)患者直腸癌組織UBQLN-1陽性表達情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。UBQLN-1陽性表達的直腸癌患者5年無病生存率明顯低于陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。T分期（HR = 1.246）、淋巴結轉移（HR = 2.538）、肝轉移（HR = 2.256）及UBQLN-1表達（HR = 5.820）是影響患者預后的獨立危險因素（P < 0.05）。 結論 直腸癌組織中UBQLN-1高表達與直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移關系密切，同時是直腸癌患者預后的獨立危險因素，因而可作為直腸癌早期診斷、預后評估的潛在分子生物學指標。

[關鍵詞] 泛素-1;直腸癌;表達;臨床意義;預后

[中圖分類號] R735.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）09（a）-0033-05

Analysis of UBQLN-1 expression and clinical significance in rectal cancer tissues and correlation with prognosis

[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of ubiquitin-1 （UBQLN-1） in rectal cancer， and correlation analysis with prognosis . Methods From December 2015 to January 2016， a total of 90 patients who underwent rectal cancer surgery in the Department of General Surgery of the First Affiliated Hospital Hebei North University were selected. The rectal cancer foci and normal tissues adjacent to the cancer were collected. Reverse transcription polymerase chain reaction （Rt-PCR） was used. The expression of UBQLN-1 mRNA of specimens in the two groups were detected， while immunohistochemistry was used to detect the expression of UBQLN-1 protein of specimens in the two groups， and the relationship with the clinicopathological characteristics of the tumor was analyzed. The survival period of the included patients was followed up， Kaplan-Meier was used to draw survival curves， and the relationship between the expression of UBQLN-1 protein and the prognosis of rectal cancer patients were analyzed by multi-factor prognosis. Results The relative expression of UBQLN-1 mRNA in rectal cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues adjacent to cancer， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The positive expression of UBQLN-1 in rectal cancer tissues was significantly higher than that in normal tissues adjacent to cancer， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. The positive expression of UBQLN-1 in rectal cancer tissues of patients with different levels of differentiation， T stage， lymph node metastasis and liver metastasis were compared， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The 5-year disease-free survival rate of rectal cancer patients with positive expression of UBQLN-1 was significantly lower than that of patients with negative expression， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. T staging （HR = 1.246）， lymph node metastasis （HR = 2.538）， liver metastasis （HR = 2.256） and UBQLN-1 expression （HR = 5.820） were independent risk factors that affected the prognosis of patients （P < 0.05）. Conclusion The high expression of UBQLN-1 in rectal cancer tissue is closely related to the occurrence， development， invasion and metastasis of rectal cancer. It is also an independent risk factor for the prognosis of rectal cancer patients. Therefore， it can be used as a potential molecular biological indicator for early diagnosis and prognosis evaluation of rectal cancer.

[Key words] Ubiquitin-1; Rectal cancer; Expression; Clinical significance; Prognosis

近年來，盡管在直腸癌的診斷和治療方法上取得了一定的進展，但是因為在早期篩查、早期診斷及規(guī)范性治療方面缺乏特異性強、準確度高的標志物作為科學參考，多數(shù)患者失去了最佳治療的時機。因而，篩選快速、準確、有效的腫瘤因子為結直腸癌的早期診斷，以及規(guī)范治療、預后監(jiān)測已成為臨床工作的重點[1-2]。另一方面，靶向治療已成為結直腸癌治療的重要手段，深入探討直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制能為結直腸癌的靶向治療提供科學、準確的靶點，即精準醫(yī)療[3-5]。泛素-1（UBQLN-1）屬于泛素樣蛋白一族，在調節(jié)蛋白質降解中起著重要作用。在真核生物中，UBQLN-1連接蛋白酶體和泛素化蛋白質，以刺激泛素化蛋白質降解，促進錯誤折疊的自噬調節(jié)[6]。UBQLN-1功能的失活可誘導人類多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程，如阿爾茨海默病和亨廷頓病等[7-9]。此外，UBQLN-1與人類多種腫瘤的發(fā)生和進展有關，目前已得到證實的惡性腫瘤有乳腺癌、胃癌、非小細胞癌和卵巢癌等[10]，但UBQLN-1在結直腸癌中的表達及相應的作用機制尚未見報道。本研究通過對直腸癌組織行逆轉錄聚合酶鏈反應法（Rt-PCR）和免疫組織化學（SP）法分析檢測，旨在探討UBQLN-1在直腸癌中的表達情況及與相關臨床病理特征的關系，并通過積極的生存期隨訪，分析UBQLN-1與預后的相關性，為直腸癌的早期篩查診斷和預后監(jiān)測提供潛在可靠的分子生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

于2015年12月—2016年1月，收集河北北方學院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）普通外科手術切除的直腸癌組織90例和癌旁正常組織90例。癌組織取自癌灶中心處，另取標本殘端切緣（距離癌灶>10 cm）經(jīng)病理證實為正常腸組織，術后標本均在離體1 h內獲得，并存于液氮中。納入患者均有完整臨床資料和隨訪記錄，其中男52例，女38例;年齡36～72歲，中位年齡55歲;T1期6例，T2期18例，T3期50例，T4期6例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：經(jīng)病理檢查確診均為原發(fā)腫瘤，病例和隨訪資料完整;排除標準：行術前新輔助放化療，伴轉移瘤、復發(fā)腫瘤，伴有心腦血管疾病及其他手術禁忌證。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑? 反轉錄試劑盒（貨號：K1622）購于美國Fermentas公司，引物購于中國廣州鼎國生物科技有限公司，RIPA試劑（貨號：PP1901）購于上?；巧锟萍加邢薰?，鼠抗UBQLN-1單克隆抗體（編號：128011）購于美國Abcam公司，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（貨號：PV9000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 Rt-PCR法檢測兩組細胞中UBQLN-1 mRNA的表達? 提取測定總RNA，設計UBQLN-1上游引物：5′-AGAGGCCAGGTTACCCACCA-3′，下游引物：5′-TTA-TGCCTCCACCGTAACCTTTG-3′;β-actin上游引物：5′-TCGACAACGGCTCCGGCAT-3′，下游引物：5′-AA-GGTGTGGTGCCAGATTTTC-3′;反應體系：1×PCR Buffer 2.5 μL，cDNA模板2 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶1.25 U，引物各1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，加焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的水至總體積25 μL。擴增條件：95℃預變性5 min后，94℃ 30 s、64℃ 30 s、72℃ 30 s，進行35個循環(huán)，最后于72℃延伸7 min，產物經(jīng)瓊脂電泳后以Labworks 4.5圖像系統(tǒng)分析。

1.2.3 免疫組化檢測兩組中UBQLN-1蛋白中的表達 分別取入組患者的直腸組織標本，用4%甲醛溶液固定（固定液量為組織的10倍），然后石蠟包埋、連續(xù)切片（厚度3 μm/張）。采用免疫組織化學染色SP法對直腸癌組織中的UBQLN-1的表達情況進行檢測。將包埋好的石蠟依次進行切片、脫蠟和水化，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，3 min/次，抗原修復自然冷卻至室溫，阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗，37℃孵育60 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育10 min，PBS液沖洗3次，3 min/次，DAB顯色，室溫孵育10 min，復染，分化、返藍，脫水、封片，顯微鏡40×鏡檢并采圖。

1.3 判定標準

UBQLN-1蛋白陽性表達為棕黃色或棕褐色，主要位于細胞質中，少量表達于細胞核，染色評分標準：陽性細胞0%～<10%為0分，10%～<25%為1分，25%～ <50%為2分，50%～<75%為3分，≥75%為4分;根據(jù)染色強度評分：無染色0分，弱染色1分，中等染色2分，強染色3分;兩項評分的乘積為最終評分，總積分≤3分為陰性，>3分為陽性[11-12]。

1.4 隨訪

通過電話/門診復查等形式積極隨訪，末次隨訪時間為2020年5月，隨訪終點為腫瘤相關性死亡。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。UBQLN-1蛋白表達與臨床病理特征的相關性采用χ2檢驗分析，應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-Rank檢驗分析不同表達患者生存期的差異。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR法檢測UBQLN-1mRNA在不同直腸組織中的表達

UBQLN-1/βaction比值作為RT-PCR定量分析，直腸癌組織中UBQLN-1 mRNA的表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（t = 6.411，P = 0.000）。見圖1。

2.2 免疫組化法檢測UBQLN-1蛋白在不同直腸組織中的表達

直腸癌組織中UBQLN-1的陽性表達明顯高于癌旁正常組織，差異有高度統(tǒng)計學意義（χ2 = 24.155， P = 0.000）。見圖2（封三）。

2.3 UBQLN-1在直腸癌組織中的表達及與病理特征的關系

不同年齡、腫瘤大小患者直腸癌組織中UBQLN-1陽性表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。不同分化程度、T分期、淋巴結轉移及肝轉移狀態(tài)患者直腸癌組織UBQLN-1陽性表達情況比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.4 UBQLN-1表達與直腸癌患者預后的相關性

本研究共納入90例患者，成功隨訪患者78例，總隨訪率為86.67%，中位隨訪時間為47個月。其中UBQLN-1表達陽性患者53例，表達陰性患者25例;自患者接受治療開始至隨訪結束，死亡26例，其中與腫瘤相關性死亡21例，與腫瘤無關性死亡5例。應用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線顯示，UBQLN-1陽性表達的直腸癌患者5年無病生存率明顯低于陰性表達者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2 = 4.879，P = 0.027）。見圖3。

2.5 直腸癌患者預后危險因素分析

T分期（HR = 1.246）、淋巴結轉移（HR = 2.538）、肝轉移（HR = 2.256）及UBQLN-1表達（HR = 5.820）是影響患者預后的獨立危險因素（P < 0.05）。見表2。

3 討論

UBQLN-1屬于泛素蛋白家族中的核小體表面蛋白，由11個外顯子組成，位于人類染色體9q22，具有高度保守性，包含N端的UBL結構域，介導泛素與蛋白酶體19S亞基的S5a組分的泛素相互作用基序的相互作用。這些特征顯示，UBQLN-1通過連接泛素化機制和蛋白酶體來調節(jié)蛋白酶體的降解。UBQLN-1還含有獨特的保守的天冬酰胺和脯氨酸重復序列，可能介導泛素與特定蛋白結構域的相互作用，這些結構域存在于許多參與內吞和囊泡分選的蛋白質中[13-15]。

UBQLN-1在不同的蛋白質降解機制和途徑中發(fā)揮重要作用，包括泛素-蛋白酶體系統(tǒng)、自噬和內質網(wǎng)相關蛋白降解途徑。通過與蛋白酶體的多泛素鏈結合及與蛋白酶體的亞單位相互作用，介導蛋白酶體靶向錯誤折疊或積累的蛋白質進行降解[16-17]。此外，與內質網(wǎng)定位蛋白的相互作用，在多泛素化的內質網(wǎng)相關的降解途徑（ERAD）底物和蛋白酶體間形成聯(lián)系。同時，自噬途徑降低銜接分子1（TICAM1）的豐度，對TICAM1/TRIF依賴的Toll樣受體信號通路進行負性調節(jié)，促進泛素化和蛋白酶體降解[18-19]。

隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)UBQLN-1能通過促進錯誤折疊的自噬調節(jié)、誘導細胞凋亡和受體轉運等多種調控機制影響腫瘤細胞的遷移和侵襲等生物學行為[20-21]。Bao等[22]應用IHC法檢測UBQLN-1在179對胃癌及鄰近正常組織中的表達水平，UBQLN-1在胃癌組織中顯著上調，其高表達與組織學分級、浸潤、淋巴結轉移和腫瘤TNM分期均有關。此外，多因素預后分析顯示，UBQLN-1高表達是胃癌患者預后的獨立不良預后因素。付慧等[23]研究證實UBQLN-1在浸潤性乳腺癌組織中呈相對高表達狀態(tài)，并與腫瘤大小、TNM分期、脈管浸潤、淋巴結轉移個數(shù)、神經(jīng)侵犯、Ki-67、遠處轉移等多種臨床病理學特征關系密切，且與患者不良預后密切相關，可作為乳腺癌患者的預后監(jiān)測的生物學指標。王靜等[24]亦證實UBQLN-1在卵巢癌組織中的表達水平相對較高，與卵巢癌的臨床病理參數(shù)及生存預后關系密切，因而可作為卵巢癌篩查、診斷、治療和預后評估的潛在生物學指標。

目前，暫未有UBQLN-1在直腸癌中表達和作用機制的相關報道。本研究應用RT-PCR和SP法檢測UBQLN-1在直腸癌中的表達情況，分析與相關臨床病理特征的關系。本研究結果顯示，癌組織中UBQLN-1 mRNA和蛋白的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤T分期、淋巴結轉移和肝轉移等病理特征密切相關。通過生存期隨訪和多因素預后分析證實，UBQLN-1的表達與直腸癌患者預后存在明顯的相關性，UBQLN-1是直腸癌患者預后的獨立危險因素。然而，具體致癌機制暫不明確。胡潺潺等[25]研究證實，抑制乳腺癌細胞中UBQLN-1基因表達可降低乳腺癌細胞增殖活力和侵襲、轉移能力，能誘導細胞凋亡，考慮與抑制STAT3信號通路，下調基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達有關。

綜上，關于UBQLN-1在腫瘤領域中的研究目前相對較少，本研究證實UBQLN-1可作為直腸癌早期診斷、預后評估的潛在分子生物學指標，具體作用機制尚需深入研究，這也是今后的研究方向。

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（收稿日期：2020-06-04）