王光宇，趙興鵬，王秀吉，趙京芬，陳 敏*

(1. 北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 甘肅省祁連山水源涵養(yǎng)林研究院，甘肅張掖 734000； 3. 北京市豐臺(tái)區(qū)園林綠化局林業(yè)工作站，北京 100055)

美國(guó)白蛾HyphantriacuneaDrury，又稱秋幕毛蟲，屬鱗翅目Lepidoptera燈蛾科Arctiidae，是我國(guó)最重要的外來(lái)入侵害蟲之一，也是國(guó)際性檢疫害蟲。美國(guó)白蛾原產(chǎn)于北美，后傳入歐洲和亞洲(羅立平，2018)。我國(guó)1979年首次在遼寧省丹東地區(qū)發(fā)現(xiàn)該害蟲(于長(zhǎng)義，1993)。目前，我國(guó)疫區(qū)已擴(kuò)散至13個(gè)省(區(qū)、市)共計(jì)589個(gè)縣級(jí)行政區(qū)(國(guó)家林業(yè)和草原局2019年第7號(hào)公告)。該害蟲寄主范圍非常廣泛，世界范圍內(nèi)的寄主植物超過(guò)600多種(Sullivan, 2012)，在我國(guó)主要危害桑NorusalbaL.、洋白蠟FraxinuspennsylvanicaMarsh、臭椿AilanthusaltissimaMill等(李路莎等，2018)，對(duì)我國(guó)的林業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境造成巨大破壞。昆蟲的消化道結(jié)構(gòu)會(huì)直接影響其運(yùn)輸、消化、吸收營(yíng)養(yǎng)成分的效率(Basseyetal., 2006; 張小民等，2007)。對(duì)美國(guó)白蛾消化道的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的研究，有助于解釋其多食性、耐饑餓能力強(qiáng)等生物學(xué)習(xí)性。

由于生存環(huán)境和食料的多樣化，昆蟲不同類群的消化道的形態(tài)和結(jié)構(gòu)存在很大差異(李慶龍, 2015)。南宮自艷等(2015)通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大蠟螟GalleriamellonellaZinne幼蟲的前胃內(nèi)膜上具有棘狀結(jié)構(gòu)，并推測(cè)此結(jié)構(gòu)與取食蜂蠟類食物相關(guān)；Chen等(2016a)對(duì)舞毒蛾LymantriadisparL.幼蟲消化道進(jìn)行研究，詳細(xì)描述了舞毒蛾消化道各部分的組織、形態(tài)及功能。程云吉(1998)通過(guò)對(duì)棉鈴蟲Helicoverpaarmigera消化道及馬氏管的解剖，闡明了幼蟲期至化蛹前期馬氏管的變化，并討論了鱗翅目幼蟲經(jīng)蛹期轉(zhuǎn)變?yōu)槌上x過(guò)程中馬氏管的變化存在的兩種不同形式。Correia(2009)發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾P(guān)rodenialituraFabriciu幼蟲取食噴灑了印楝素(Neemseto)的葉子后，消化道的形態(tài)發(fā)生了改變；Grant(2006)通過(guò)對(duì)比受到外界刺激的鱗翅目幼蟲的消化道各部分的比例與回流現(xiàn)象的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)前腸占比大、中腸占比較小的消化道的回流現(xiàn)象更加明顯。一些鱗翅目幼蟲則利用其回流的生物學(xué)習(xí)性作為抵御和阻止無(wú)脊椎動(dòng)物攻擊的最有效防御手段之一(Gentry and Dyr, 2002)。

本研究通過(guò)對(duì)美國(guó)白蛾6齡幼蟲消化系統(tǒng)的石蠟切片顯微觀察，結(jié)合掃描電子顯微鏡與透射電子顯微鏡技術(shù)，對(duì)美國(guó)白蛾消化系統(tǒng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述分析，為闡明美國(guó)白蛾消化道各結(jié)構(gòu)的功能及其生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)所用的美國(guó)白蛾幼蟲為實(shí)驗(yàn)室人工飼料飼養(yǎng)，人工飼料配方和飼養(yǎng)方法參照曹利軍等(2014)的方法。飼養(yǎng)條件：25℃，光照16 h ∶8 h，濕度70%～80%。選取生長(zhǎng)狀況良好、大小相同的6齡幼蟲，于75%乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1光學(xué)顯微鏡觀察

1.2.1.1 消化道整體觀察

取出美國(guó)白蛾6齡幼蟲，用解剖剪和鑷子沿腹部末端中線解剖蟲體，小心取出整個(gè)消化道，將消化道外壁的氣管及脂肪體去除，用0.1 M(pH=7.4)的磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，用體視顯微鏡Leica M205FA拍照，識(shí)別消化道各部分，共解剖了50頭美國(guó)白蛾6齡幼蟲，對(duì)其前腸、中腸、后腸的長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.1.2 石蠟切片觀察

美國(guó)白蛾6齡幼蟲石蠟切片的制作參照Baggio(2014)的方法。將解剖好的消化道浸入Duboseq-Brasil固定液固定24 h。經(jīng)30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液逐級(jí)脫水。用二甲苯進(jìn)行透明，石蠟包埋。用手動(dòng)切片機(jī)(Leica RM2126RT)切片，厚度為7 μm。將切片置于兩缸二甲苯中脫蠟兩次，每次20 min，后用二甲苯、乙醇(1 ∶1)溶液→無(wú)水乙醇→95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→蒸餾水處理，在2.5%鐵礬液中咬色15 min，經(jīng)蒸餾水漂洗后，再置于鉀礬蘇木精染色劑中染色15 min。然后脫水至90%酒精后，將切片放到95%酒精伊紅染色劑中作雙重染色。將染好色的切片經(jīng)30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇、伊紅→95%乙醇→無(wú)水乙醇，逐級(jí)脫水各5 min，然后經(jīng)1/2無(wú)水乙醇+1/2二甲苯→二甲苯透明3 min。最后用中性樹膠封片，利用光學(xué)顯微鏡(Axio Zoom.V16)對(duì)組織切片進(jìn)行觀察分析。

1.2.2掃描電子顯微鏡觀察

掃描電子顯微觀察參照Chen(2016a)的方法，將沖洗過(guò)的幼蟲消化道用2.5%的戊二醛固定液(PBS 0.1 M，pH=7.4)在4℃下固定24 min，然后用PBS沖洗3次，再用重蒸水沖洗。為了觀察消化道的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在脫水前先用解剖剪解剖，再用磷酸緩沖液(0.1 M，pH=7.4)將內(nèi)容物沖洗掉。分別用50%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度脫水15 min；脫水結(jié)束后，用乙醇-叔丁醇溶液(1 ∶1，V/V)置換20 min，最后用100%叔丁醇置換兩次，每次30 min。將處理好的樣品在-20℃條件下預(yù)冷1 h，再在冷凍干燥儀(ES-2030)中進(jìn)行冷凍干燥處理。干燥后的樣品使用離子濺射儀噴鍍后，進(jìn)行掃描電子顯微鏡(日立S-3400N II)觀察和拍照。

1.2.3透射電子顯微鏡觀察

透射電子顯微觀察參照Wang等(2018)的方法，將消化道放入2.5%戊二醛固定液(PBS 0.1 M，pH=7.4)中固定24 h，固定后用0.1 M(pH=7.4)的磷酸鹽緩沖液重復(fù)漂洗20次。清洗后的樣品加入1%鋨酸溶液固定3 h，再用磷酸緩沖液沖洗兩次。依次用50%、70%、80%、90%、95%和100%酒精進(jìn)行梯度脫水，每濃度梯度浸泡20 min。脫水完畢的樣品在1 h內(nèi)用丙酮沖洗 6次，置換出殘余的酒精。用國(guó)產(chǎn)環(huán)氧樹脂618在恒溫箱中進(jìn)行滲透，滲透條件為28℃，72 h。將樣品移至包埋板用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋，再將包埋板置于烘箱內(nèi)加熱，最終加熱溫度為50℃，利用超薄切片機(jī)(Leica EM-UC6)進(jìn)行超薄切片(50 nm)，選取完整的切片置于銅網(wǎng)上，利用醋酸鉛溶液染色；然后置于透射電鏡(JEM-1010)下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 美國(guó)白蛾幼蟲消化道整體結(jié)構(gòu)

圖1 美國(guó)白蛾6齡幼蟲消化道整體結(jié)構(gòu)Fig.1 The morphology of the 6th instar larval alimentary canal in Hyphantria cunea Drury注：FG，前腸；MG，中腸；HG，后腸；Ph，咽；Oe，食道；Cr，嗉囊；Pr，前胃；SG，絲腺；Mt，馬氏管；Py，幽門；IL，回腸；Co，結(jié)腸；Re，直腸。Note：FG, foregut; MG, midgut; HG, hindgut; Ph,Pharynx;Oe, oesophagus; Cr, crop; Pr, proventriculus; SG, silk gland; Mt, malpighian tubule; Py, Pylorus; IL, ileum; Co, colon; Re, rectum.

美國(guó)白蛾的消化道為淡黃色，整體呈管狀，分為前腸、中腸、后腸和附屬結(jié)構(gòu)(絲腺和馬氏管，圖1)。馬氏管著生于中后腸交界處，附著在中、后腸的外壁上；絲腺共兩條，發(fā)源于咽，前部較細(xì)而后部較粗(圖1)。6齡幼蟲消化道平均長(zhǎng)度為24.703±0.223 mm，其中，前腸最長(zhǎng)，平均長(zhǎng)度為13.407±0.179 mm，占消化道總長(zhǎng)度的54.27%；中腸最短，平均長(zhǎng)度5.256±0.058 mm，占消化道總長(zhǎng)的21.28%；后腸6.039±0.177 mm，占消化道總長(zhǎng)度的24.47%。

2.2 前腸

美國(guó)白蛾幼蟲前腸分為咽、食道、嗉囊、前胃四部分(圖1)，以賁門瓣與中腸分界。掃描電鏡(日立S-3400N II)觀察表明，其上唇下緣為“W”型，內(nèi)壁有許多向后的微棘(圖2-A)。咽部?jī)?nèi)壁光滑，食道前部較細(xì)，后端漸漸變粗與嗉囊連接(圖1和圖2-B)，外側(cè)連接處觀察到發(fā)達(dá)的縱肌(圖2-B)。嗉囊為食道后的一個(gè)膨大結(jié)構(gòu)，外觀與前胃相似(圖1)，均呈管狀，石蠟切片觀察表明其外壁的環(huán)肌發(fā)達(dá)，內(nèi)膜為深褶皺狀且表面不光滑(圖2-C)。前胃腸壁較薄，外部由縱肌與環(huán)肌包裹(圖2-D)，內(nèi)膜觀察到爪狀棘刺結(jié)構(gòu)(圖2-E)，末端著生薄膜狀賁門瓣伸向中腸內(nèi)(圖2-F)。

圖2 美國(guó)白蛾6齡幼蟲前腸電鏡(A、B、E)、石蠟切片(C、D)和體視鏡(F)觀察Fig.2 Foregut electron microscope (A, B, E), paraffin section (C, D) and stereoscopic microscope (F) of the 6th instar larvae of Hyphantria cunea Drury注：A，上唇內(nèi)側(cè)與咽；B，食道與嗉囊交界處；C，嗉囊橫切；D，前胃橫切；E，前胃內(nèi)膜；F，賁門瓣。Cm，環(huán)?。籌n，內(nèi)膜；L，腸腔；El，腸壁細(xì)胞層；Lm，縱肌；Fd，食物；Sp，棘刺；Oe，食道；Ph，咽；Cv，賁門瓣。Note：A, inner side of labrum and pharynx; B, the junction of oesophagus and crop; C, crop trasection; D, proventriculus trasection; E, intima of proventriculus; F, the cardiac valve. Cm, circular muscle; In, intima; L, lumen; El, epithelial layer; Lm, longitudinal muscle; Fd, food; Sp, spinule; Oe, oesophagus; Ph, pharynx; Cv, cardiac valve.

2.3 中腸

中腸位于賁門瓣與幽門瓣之間，整體呈粗細(xì)均勻的管狀(圖1)。石蠟切片顯示，中腸的外壁肌肉發(fā)達(dá)，呈深內(nèi)褶狀，內(nèi)有一層圍食膜(圖3-A)。腸壁細(xì)胞層發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞，分別為杯狀細(xì)胞、柱狀細(xì)胞與再生細(xì)胞(圖3-B和圖3-G)。消化道腹面中央有兩條發(fā)達(dá)縱肌附著在環(huán)肌上(圖3-C)，中腸外環(huán)肌比嗉囊外壁環(huán)肌粗，縱肌緊密貼合在環(huán)肌外，有氣管附著于外壁肌肉上，通過(guò)分支插入肌肉組織內(nèi)部(圖3-D)。中腸內(nèi)壁觀察到密集的刷狀絨毛，上面分布著大小不一的囊泡(圖3-I和圖3-J)。圍食膜表面光滑，將食物與上皮細(xì)胞隔離開(圖3-E)。

館長(zhǎng)被磚子氣吞萬(wàn)里如虎的氣勢(shì)說(shuō)得張口結(jié)舌，暗忖那些有鼻子有眼睛的事莫非是假的？可有人反映到文化局了，我是代表局長(zhǎng)來(lái)找他探口風(fēng)以期交流的。他娘的，沒(méi)有就算，關(guān)我鳥事啊。

通過(guò)組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，在中腸上皮細(xì)胞中，柱狀細(xì)胞與杯狀細(xì)胞為主要組成部分，呈相間排列(圖3-G)，杯狀細(xì)胞胞壁內(nèi)側(cè)著生大量微絨毛(圖3-G)；再生細(xì)胞位于上皮組織底部，細(xì)胞核較大，呈游離分布(圖3-H)；柱狀細(xì)胞頂膜上分布著大量微絨毛(圖3-I)，在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)觀察到大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和囊泡(圖3-F)。

2.4 后腸

后腸以幽門與中腸連接，由回腸、結(jié)腸和直腸組成(圖4-C和圖4-D)。幽門外壁為馬氏管著生的位置。幽門由幽門錐(圖4-D)與幽門瓣(圖4-E)構(gòu)成，幽門瓣內(nèi)部為發(fā)達(dá)的瓣?duì)罴∪猓獗跒榄h(huán)肌層(圖4-A和圖4-E)?；啬c球狀，腸壁薄，外層為單層上皮細(xì)胞(圖4-B和圖4-D)，后端連接結(jié)腸。結(jié)腸直徑比回腸略寬，呈管狀，外壁由兩層交錯(cuò)的環(huán)肌纖維組成，內(nèi)部包裹著包狀突起的膜且膜內(nèi)壁光滑(圖4-F)。直腸較薄，肌肉主要為縱肌且內(nèi)外各有一層膜包裹(圖4-H)。

2.5 附屬結(jié)構(gòu)

馬氏管呈螺旋狀，外壁光滑(圖5-B)，共6根，著生于幽門外壁對(duì)稱著生的柄，然后膨大為囊狀結(jié)構(gòu)(圖5-A)，稱之為膀胱。膀胱另一端向外延伸出一條馬氏管，隨后分叉為3條。

絲腺共有2條，起源于咽部，前半部分較短而細(xì)，后半部分較長(zhǎng)且粗，位于消化道兩側(cè)(圖1，圖5-C)。對(duì)絲腺的橫切觀察發(fā)現(xiàn)，絲腺由管狀膜與內(nèi)容物構(gòu)成(圖5-D)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)合了光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡與透射電子顯微鏡技術(shù)，對(duì)美國(guó)白蛾6齡幼蟲消化道的形態(tài)特征進(jìn)行了研究。美國(guó)白蛾幼蟲消化道的整體形態(tài)為直管狀結(jié)構(gòu)，與其它鱗翅目幼蟲的消化道結(jié)構(gòu)相似(Sousaetal., 2009; Chen, 2016b; Wangetal., 2018)。

美國(guó)白蛾中腸較短，占整個(gè)消化道的21.28%，具有吸收、分解食物并代謝有毒物質(zhì)等作用(Sousaetal., 2009；Wangetal., 2018)。雖然美國(guó)白蛾的中腸很短，但對(duì)食物仍有較高(38%)的同化率(Schroeder and Malmer, 1980)。共發(fā)現(xiàn)了3種上皮細(xì)胞，杯狀細(xì)胞、柱狀細(xì)胞與再生細(xì)胞，其中以柱狀細(xì)胞與杯狀細(xì)胞為主，與其它鱗翅目幼蟲如大豆夜蛾AnticarsiagemmatalisHübner(Levyetal., 2004)、小蔗螟DiatraeasaccharalisFabricius(Pinheiroetal., 2008)等的中腸上皮細(xì)胞種類一致。杯狀細(xì)胞能夠控制鉀離子和鈣離子的流動(dòng)，進(jìn)而控制腸道中的水推動(dòng)食物流動(dòng)(Levyetal., 2004)；柱狀細(xì)胞中的大量線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為柱狀細(xì)胞產(chǎn)生消化酶及囊泡提供充足的支持，而后消化酶通過(guò)胞吐作用被分泌消化酶到中腸，在食物的消化中起著十分重要的作用(Lehane, 1995)，在柱狀細(xì)胞的頂端觀察到大量的微絨毛，這些微絨毛大大增加了腸壁的吸收面積；再生細(xì)胞位于上皮組織的底部，數(shù)量較少且呈游離分布，它們分裂增殖并一部分分化為柱狀細(xì)胞以作為消亡后柱狀細(xì)胞的補(bǔ)充(Sousaetal., 2009)。腸壁內(nèi)側(cè)有一單層圍食膜，圍食膜用于包裹住食物，將食物與上皮細(xì)胞隔離開，防止上皮細(xì)胞受到食物的物理?yè)p傷和微生物侵害(Zhongetal., 2013)。

圖3 美國(guó)白蛾6齡幼蟲中腸石蠟切片(A、B)和電鏡(C-J)觀察Fig.3 Midgut paraffin section (A, B) and electron microscope (C-J) of the 6th instar larvae of Hyphantria cunea Drury注：A，中腸縱切；B，中腸橫切；C，中腸腹面；D，中腸外壁肌肉；E，圍食膜；F，中腸腸壁結(jié)構(gòu)；G，杯狀細(xì)胞與柱狀細(xì)胞；H，再生細(xì)胞；I，微絨毛；J，中腸內(nèi)壁。Mw, 腸壁; Pm, 圍食膜; Ep, 上表皮; Cc, 柱狀細(xì)胞; Gc, 杯狀細(xì)胞; Rc, 再生細(xì)胞; Mt, 馬氏管; Lm, 縱肌; Tr, 氣管; Cm, 環(huán)肌; M, 線粒體; Mi, 微絨毛; Rer, 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng); Ve, 囊泡; Nu, 細(xì)胞核。Note：A，midgut longitudinal section；B，midgut transection；C，the ventral surface of the midgut；D，midgut outer wall；E，peritrophic membrane；F，midgut intestinal wall structure；G，goblet cell and columnar cell；H，regenerative cell；I，microvilli；J，midgut inner wall. Mw, midgut wall; Pm, peritrophic membrane; Ep, epithelium; Cc, columnar cell; Gc, goblet cell; Rc, regenerative cell; Mt, malpighian tubule; Lm, longitudinal muscle; Tr, tracheae; Cm, circular muscle; M, mitochondria; Mi, microvilli; Rer, rough endoplasmic reticulum; Ve, vesicles; Nu, nucleus.

圖4 美國(guó)白蛾6齡幼蟲后腸石蠟切片(A、B)、體視鏡(C)和電鏡(D-H)觀察Fig.4 Hindgut paraffin section (A, B),stereoscopic microscope (C) and electron microscope (D-H) of the 6th instar larvae of Hyphantria cunea Drury注：A，幽門橫切；B，回腸橫切；C，后腸；D，中后腸連接處；E，幽門瓣；F，結(jié)腸外表面；G，結(jié)腸內(nèi)膜；H，直腸橫切。Cm, 環(huán)肌; Pt, 瓣?duì)罴∪? Mt, 馬氏管; El, 腸壁細(xì)胞層; MG, 中腸; Co, 結(jié)腸; Re, 直腸; PC, 幽門錐; IL, 回腸; Ec, 外膜; In, 內(nèi)膜。Note：A，pyloric transection；B，ileum transection；C，hindgut；D，the junction of midgut and hindgut；E，pyloric valve；F，colon outer surface；G，colon intima；H，rectal transection. Cm, circular muscle; Pt, petal muscle; Mt, malpighian tubule; El, epithelial layer; MG, midgut; Co, colon; Re, rectum; PC, pyloric cone; IL, ileum; Ec, ectoblast; In, intima.

圖5 美國(guó)白蛾6齡幼蟲馬氏管和絲腺掃描電鏡觀察Fig.5 The malpighian tubule and silk glands electron microscope (A-D) of 6th instar larval of Hyphantria cunea Drury注：A，馬氏管起源處；B，馬氏管；C，絲腺；D，絲腺橫切。BL, 膀胱; Mt, 馬氏管; SG, 絲腺。Note：A，the origin of malpighian tubule；B，malpighian tubule；C，silk gland；D，silk gland transection. BL, bladder; Mt, malpighian tubule; SG, silk gland.

后腸是美國(guó)白蛾幼蟲消化道中最復(fù)雜的一部分，分為回腸、結(jié)腸和直腸3個(gè)部分。其中，幽門前端為幽門錐，壁薄且外壁附著大量縱肌與中腸相連，后端為幽門瓣，幽門瓣由瓣?duì)羁v肌構(gòu)成，控制消化后的食物進(jìn)入回腸(Baggioetal., 2014)；回腸外觀為一球形結(jié)構(gòu)，內(nèi)壁光滑，其功能是對(duì)中腸消化后的食物進(jìn)行脫水、擠壓和下移(崔智芳等，2011)；結(jié)腸位于回腸后，表面的環(huán)肌組成的肌肉纖維比中腸細(xì)的環(huán)肌纖維很多(圖3-D 和圖4-F)。

美國(guó)白蛾幼蟲的馬氏管與其他鱗翅目幼蟲的馬氏管結(jié)構(gòu)和數(shù)量一致，在馬氏管的端部與后腸間形成隱腎結(jié)構(gòu)，在水的重吸收方面起著重要作用(程云吉，1998)。同時(shí)，馬氏管基部的囊狀結(jié)構(gòu)將體內(nèi)代謝產(chǎn)生的尿酸結(jié)晶與食物殘?jiān)旌?，并隨腸道排出體外(Gisleietal., 2004)。

研究美國(guó)白蛾幼蟲消化道的形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)，有助于進(jìn)一步探討其幼蟲的食性及系統(tǒng)發(fā)育，同時(shí)為美國(guó)白蛾幼蟲消化道的相關(guān)功能和消化機(jī)理研究提供理論依據(jù)。另外，本文僅初步描述了美國(guó)白蛾幼蟲消化道的形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)，但美國(guó)白蛾幼蟲的消化道結(jié)構(gòu)與其消化吸收功能及食性等的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。