蔡 昀，唐 燚，康非吾

正畸-正頜聯(lián)合治療是治療牙頜面畸形的主要手段。骨是一類高度血管化的結(jié)締組織[1]，頜面部骨血供豐富，同時接受向心性與離心性血供的滋養(yǎng)，其多源性的血供方式是正頜外科得以成功實施的解剖學(xué)基礎(chǔ)。同時，正頜外科手術(shù)中對頜面部進行的廣泛軟組織剝離及運用的大量骨切開術(shù)也會對全身及局部的血供產(chǎn)生影響[2-3]。

骨內(nèi)灌注減少將阻礙氧氣傳遞到牙槽骨內(nèi)的各類細胞和周圍組織，我們推測牙槽骨骨內(nèi)氧環(huán)境將發(fā)生變化同時引起骨代謝的改變?；诖耍疚闹荚谕ㄟ^建立大鼠雙側(cè)下頜升支截骨模型去血供后，分析非術(shù)區(qū)牙槽骨組織氧水平與骨代謝隨時間變化的規(guī)律，了解頜骨手術(shù)對非術(shù)區(qū)牙槽骨骨改建的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)檢測試劑(Sigma-Aldrich，德國)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶(ALP)顯色試劑盒(碧云天，中國)；甲基綠染色液(凱基，中國)；透明質(zhì)酸酶(Sigma-Aldrich，德國)；山羊血清(邁新，中國)；低氧探針-1(Hypoxyprobe -1，簡稱Hp-1)檢測試劑盒(Hypoxyprobe，美國)；DAPI染色液(Sigma-Aldrich，德國)；抗熒光淬滅劑(生工，中國)；共聚焦熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(Nikon，日本)

1.2 實驗動物與分組

本實驗選用7周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～200克，訂購于虔碧生物科技(上海)有限公司，飼養(yǎng)于同濟大學(xué)口腔醫(yī)院實驗動物中心。按隨機原則分為對照組與手術(shù)組。對照組即術(shù)前組，不做任何處理；手術(shù)組再按時間點分為術(shù)后第1、3、5、7、14天組。每組需要5只實驗大鼠(n=5)。

1.3 模型建立

所有操作均已通過同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，登記號為[2019]-DW-038。下頜升支截骨手術(shù)模式圖如圖1所示。手術(shù)組腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉溶液(劑量30 mg/kg)對大鼠進行麻醉。待麻醉顯效后，取仰臥位，在下頜骨術(shù)區(qū)備皮消毒。在無菌狀態(tài)下，于下頜下緣作弧形切口，用眼科剪分離下頜骨邊緣附著的肌肉，用骨膜分離器鈍性分離咬肌與下頜骨體，減少向心性血供并暴露下頜升支。用渦輪機在第三磨牙后4 mm，平行于下頜孔處進行垂直截骨，止于下頜體下緣，截斷下牙槽動脈，減少離心性血供，期間生理鹽水保持沖洗冷卻?？p合軟組織和皮膚并消毒。另一側(cè)以相同方式進行截骨手術(shù)。剪去上下頜切牙，防止其過度生長。待大鼠清醒后安返籠位。術(shù)后喂予軟質(zhì)飼料并以8萬單位/d劑量腹腔注射青霉素3 d。

A：下頜骨外面觀;B：下頜骨內(nèi)面觀

1.4 低氧探針標(biāo)記與免疫熒光染色

低氧探針-1(Hp-1)是一種2-硝基咪唑替代物，主要成分是鹽酸吡莫硝唑(pimonidazole HCl)，可在細胞水平標(biāo)記低氧狀態(tài)。在大鼠處死前2 h，以60 mg/kg劑量腹腔注射Hp-1溶液。注射后，Hp-1將分布到體內(nèi)所有組織，但僅在氧濃度小于14 μmol/L(相當(dāng)于在37 ℃時分壓p(O2)=10 mmHg)的細胞中與含硫醇的蛋白質(zhì)形成加合物。

標(biāo)記完成后，對大鼠進行過量麻醉灌流后分離下頜骨，于4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣完全后，進行石蠟包埋，平行于第一磨牙長軸切片，切片厚度為5 μm。常規(guī)脫蠟水化后，使用透明質(zhì)酸酶在37 ℃烘箱孵育1 h進行抗原修復(fù)，山羊血清封閉20 min，加入鼠抗吡莫硝唑IgG1單克隆抗體工作液(1∶50)，于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。隔日避光孵育熒光二抗(1∶500)45 min，PBS洗3次，DAPI(1∶1 000)孵育5 min，抗熒光淬滅劑封片，鏡檢。

1.5 組織學(xué)染色

如前所述，制備5 μm組織切片。常規(guī)脫蠟水化后，分別使用TRAP染色試劑盒檢測骨吸收功能，使用ALP染色試劑盒檢測骨形成功能，甲基綠復(fù)染10 min，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用image J軟件對樣本染色圖進行分析獲得相關(guān)定量結(jié)果，即隨機視野下，采用color threshold獲取陽性染面積，計算陽性面積占視野面積的百分比。使用PRISM 7.0軟件和SPSS 24.0進行作圖及統(tǒng)計學(xué)分析。多組之間通過單因素方差分析與Tukey多重比較法進行檢驗。所有計量數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，定義當(dāng)P<0.05時說明實驗結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.000 1)。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后第一磨牙區(qū)域牙槽骨骨內(nèi)氧水平變化

通過低氧探針聯(lián)合免疫熒光染色評估下頜升支骨截骨術(shù)后牙槽骨氧水平的變化，當(dāng)氧濃度低于14 μmol/L時，標(biāo)記為綠色，認(rèn)定處于低氧狀態(tài)。選擇第一磨牙牙根之間的牙槽骨作為觀察區(qū)域。如圖2A所示，在術(shù)后第一磨牙區(qū)域牙槽骨出現(xiàn)了低氧強陽性信號，骨內(nèi)低氧程度隨時間發(fā)生變化。通過定量分析發(fā)現(xiàn)(圖2B)，術(shù)后第1天(10.69±2.13)%、第3天(11.37±2.74)%低氧相對面積與術(shù)前(2.84±2.23)%相比顯著增加(P<0.000 1)，術(shù)后第5天(7.66±3.51)%低氧相對面積有所下降，但仍較術(shù)前有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，術(shù)后第7天(4.64±1.92)%及第14天(5.15±1.98)%與術(shù)前相比，低氧面積無顯著性差異(P>0.05)，低氧狀態(tài)緩解。

A：術(shù)前及術(shù)后第1、3、5、7、14天第一磨牙區(qū)域牙槽骨低氧探針免疫熒光染色圖；藍色：DAPI；綠色：Hp-1；標(biāo)尺=100 μm； B：低氧相對面積定量分析；與術(shù)前組相比，**：P<0.01；****：P<0.0001

2.2 術(shù)后第一磨牙區(qū)域牙槽骨組織學(xué)表現(xiàn)

通過對第一磨牙牙根之間的牙槽骨進行TRAP染色及ALP染色評估骨改建情況，發(fā)現(xiàn)術(shù)后牙槽骨骨代謝活躍。TRAP染色(圖3A)提示術(shù)后第1天出現(xiàn)活躍的破骨細胞行骨吸收功能并持續(xù)至術(shù)后第7天。定量分析結(jié)果(圖3C)顯示：TRAP陽性染色相對面積在術(shù)后第1天(2.40±0.58)%較術(shù)前(0.57±0.39)%有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，術(shù)后第3天(3.11±0.96)%，術(shù)后第5天(3.87±1.30)%持續(xù)增加，術(shù)后第7天(5.62±1.82)%達到峰值，與術(shù)前相比統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P<0.0001)，骨吸收能力在術(shù)后第14天(1.46±0.46)%下降至術(shù)前水平(P>0.05)。ALP是早期成骨標(biāo)志，反應(yīng)了成骨細胞分化水平。ALP染色(圖3B)及其定量分析(圖3D)結(jié)果顯示：術(shù)后第1天(0.56±0.28)%，第3天(0.31±0.32)%，第5天(0.25±0.14)%牙槽骨成骨活性與術(shù)前(0.32±0.12)%無顯著性差異(P>0.05)，但在術(shù)后第7天(5.53±1.70)%，牙槽骨ALP陽性面積顯著增加(P<0.0001)，染色較深，提示ALP活性高，說明前成骨細胞向成熟的成骨細胞分化地越明顯，即早期骨向分化顯著，且在術(shù)后第14天(2.22±0.67)%仍保持較術(shù)前高水平的成骨活性。

3 討 論

氧氣是許多組織正常發(fā)育的關(guān)鍵信號，參與了不同的生命進程[4]。在骨外傷、骨腫瘤或骨質(zhì)疏松等情況下骨內(nèi)氧含量的時空分布將發(fā)生變化[5]。Epari等[6]對綿羊脛骨截骨后的骨損傷部位處進行氧張力測量，發(fā)現(xiàn)最初氧分壓較高為110 mmHg，術(shù)后5 d內(nèi)持續(xù)顯著下降，5 d后達到平臺期穩(wěn)定在20 mmHg。正頜手術(shù)骨切開線與牙槽骨有一定距離，如上頜骨水平骨切開術(shù)的骨切開線距離上頜牙根根尖5 mm，下頜升支矢狀骨劈開術(shù)的骨切開線主要在下頜升支部。因此，我們建立大鼠雙側(cè)下頜升支截骨模型，并通過低氧探針在分子水平檢測其第一磨牙牙槽骨區(qū)域內(nèi)氧分壓的變化。我們發(fā)現(xiàn)在術(shù)后早期非術(shù)區(qū)牙槽骨內(nèi)出現(xiàn)低氧微環(huán)境。雖然頜面部骨血供有廣泛的吻合支可以在術(shù)后代償，輸送營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，但骨內(nèi)和周圍的血管網(wǎng)絡(luò)受到損害，同時修復(fù)代謝需求對氧的消耗增加，仍使牙槽骨內(nèi)的低氧狀態(tài)持續(xù)5 d。氧水平的變化可以調(diào)節(jié)特定的信號級聯(lián)，例如低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)信號傳導(dǎo)途徑[7]。HIF可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄多種成血管基因編碼促進血管生成及動脈重塑，促使組織灌注恢復(fù)[8]。值得一提的是，有證據(jù)表明從下頜骨分離的成骨細胞比從股骨分離的成骨細胞擁有更強的促血管生成能力[9]。細胞從周圍血管獲得氧氣的距離需要在200 μm以內(nèi)[10]。在術(shù)后1周時，牙槽骨骨內(nèi)局部氧水平恢復(fù)到了術(shù)前基線，這可能與新生血管長入有關(guān)[11]。

A、B：術(shù)前及術(shù)后第1、3、5、7、14天第一磨牙區(qū)域牙槽骨Trap染色(A)及ALP染色(B)；C：Trap陽性染色相對面積定量分析；D：ALP陽性染色相對面積定量分析；標(biāo)尺=100 μm；*：與術(shù)前組相比，P<0.05；**：與術(shù)前組相比，P<0.01；****：與術(shù)前組相比，P<0.0001

骨內(nèi)氧水平的變化影響非術(shù)區(qū)牙槽骨骨吸收與骨形成能力。通過比較牙槽骨低氧狀態(tài)與TRAP染色數(shù)據(jù)的時間變化關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)在術(shù)后早期牙槽骨骨內(nèi)發(fā)生低氧的同時破骨骨吸收活躍并持續(xù)1周。我們初步認(rèn)為術(shù)后早期的牙槽骨骨內(nèi)低氧狀態(tài)促進了破骨骨吸收能力。據(jù)文獻報道，破骨細胞適合在低氧、酸性環(huán)境中發(fā)揮作用[12]。相比于在體外以20%和0.2% O2培養(yǎng)誘導(dǎo)條件下，2% O2孵育誘導(dǎo)的破骨細胞形成效果最佳[13]。也有研究指出，體外在低氧條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)對破骨細胞衰老有負向調(diào)控作用且能導(dǎo)致破骨細胞生成延遲，但對破骨吸收能力沒有負面影響[14]。除了低氧的嚴(yán)重程度，低氧的作用時間也會對破骨細胞生成、存活或骨吸收能力產(chǎn)生影響。短時間的急性缺氧-復(fù)氧可以增加破骨細胞活性與破骨細胞凋亡，并能維持兩者間的平衡[15]。然而，持續(xù)性地暴露在低氧環(huán)境中則會顯著抑制破骨細胞的形成和吸收功能[16]。此外，本課題組先前研究表明，體外低氧培養(yǎng)骨細胞也可以促進其分泌RANKL介導(dǎo)破骨細胞分化[17]。破骨細胞活性增強是頜骨手術(shù)后牙槽骨重塑的有利因素。骨內(nèi)低氧引起的破骨吸收增強或許可以成為臨床中可利用的加快正畸牙移動的有效措施。之后，通過比較牙槽骨低氧狀態(tài)與ALP染色數(shù)據(jù)的時間變化關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后早期骨內(nèi)低氧出現(xiàn)時，牙槽骨成骨活動不明顯，而在術(shù)后1周當(dāng)骨內(nèi)氧水平恢復(fù)到術(shù)前狀態(tài)時，則成骨分化顯著。據(jù)文獻報道，成骨細胞對氧濃度的變化極為敏感，當(dāng)細胞周圍氧氣濃度降低到5%時，成骨細胞的增殖與骨礦化結(jié)節(jié)的形成會受到強烈抑制，而當(dāng)氧濃度降低到1%時則幾乎完全消失[18]。在大鼠體內(nèi)通過系統(tǒng)性低氧-復(fù)氧會引起成骨細胞、骨細胞的凋亡[19]，但低氧微環(huán)境穩(wěn)定的HIF-1α具有抑制成骨細胞凋亡的能力，可以拮抗低氧引起的細胞活力降低[20]。

骨改建是由破骨骨吸收與成骨骨形成協(xié)調(diào)共同完成的過程[21]。本研究對術(shù)后低氧與骨改建的研究尚處于初步探討階段，這種復(fù)雜的過程需要不同類型的細胞參與，因此可以考慮進一步引入基因敲除模型動物來探究破骨細胞、成骨細胞和骨細胞等分別如何對截骨后牙槽骨的低氧作出反應(yīng)。

綜上，本文初步表明術(shù)后骨內(nèi)氧水平的變化與牙槽骨骨代謝變化有一定的時空聯(lián)系。當(dāng)下頜升支截骨去血供后，非術(shù)區(qū)牙槽骨出現(xiàn)局部低氧微環(huán)境的同時骨吸收活躍，當(dāng)?shù)脱鯛顟B(tài)緩解后骨形成能力增強。因此，可以從低氧的角度對正頜術(shù)后牙槽骨骨改建進行深入探究，以期臨床中在正頜術(shù)后利用骨代謝的變化適時介入正畸治療，實現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控。