李 爽 郝 帥 王 靜 閆 燕 趙 磊 吳婷婷 王成濤

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術研究中心 北京100048）

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率非常高的惡性腫瘤，已經(jīng)成為危害我國居民健康最主要的惡性腫瘤之一[1]。肺癌可分為非小細胞肺癌（Nonsmall cell carcinoma，NSCLC）和小細胞肺癌（Small cell carcinoma，SCLC），其中非小細胞肺癌最常見，約占肺癌發(fā)病率的85%，嚴重危害國民健康[2]。天然活性抗腫瘤物質有毒性低，活性高等優(yōu)點，是抗腫瘤研究的熱點之一。深入探究其作用機理能夠為腫瘤的靶向治療奠定基礎。

藻藍蛋白（C-phycocyanin，C-PC）是一種存在于藍藻、紅藻等藻類中的天然活性物質，在螺旋藻中含量較高[3]，是藻膽蛋白的重要組成部分。它由脫輔基蛋白亞基（α，β）和藻藍素輔基結合形成，以完整的六聚體結構存在于細胞內，擔任能量的傳遞和貯存功能[4-5]。藻藍蛋白作為天然藍色色素蛋白，具有優(yōu)良的抗氧化[6]，抗炎等活性[7]，能有效預防和治療多種疾病，已被列為我國允許使用的天然食品著色劑[8]。此外，藻藍色素蛋白在抗腫瘤方面優(yōu)勢明顯。相關研究表明藻藍色素蛋白對肝癌、乳腺癌、結腸癌、卵巢癌、宮頸癌、喉癌以及胰腺癌均有不同的抑制作用[9-15]。本研究以非小細胞肺癌A549 為模型，探究藻藍蛋白對肺癌增殖機制的影響。

RNA 干擾（RNA interfering，RNAi）是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA （Double-stranded RNA，dsRNA）引發(fā)的，廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程[16]。RNAi 技術因操作簡單，特異性強，高效性等特點，而被廣泛應用于藥物靶基因的篩選、腫瘤治療等領域[16]。Zou等[17]將外源性小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）轉染入肺癌細胞株H1975 中，抑制Bcl-2 表達，從而誘導肺癌細胞凋亡。Zhang 等[18]利用RNAi 技術，轉染MTA1 siRNA 進入喉癌細胞株HEP-2，證實了MTA1 可促進HEP-2 細胞的侵襲、黏附和遷移行為。Ying 等[19]設計了MTA1 siRNA，沉默鼻咽癌細胞株C666-1 潛伏膜聯(lián)蛋白2A 基因，使細胞周期阻滯在G0/G1 期，抑制細胞增殖。本研究采用高通量轉錄組學測序技術，對藻藍蛋白參與調控抑制肺癌細胞增殖的相關靶點進行篩選，獲得一個潛在的調控基因RIPK1，并利用RNAi 技術特異性地沉默RIPK1 的表達，驗證藻藍蛋白是否通過下調RIPK1 抑制A549 細胞的增殖和遷移。本研究結果為抗癌天然功能性物質的開發(fā)利用奠定堅實的理論基礎，同時為人類腫瘤治療提供新穎的解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RIPK1-siRNA、陰性對照siRNA，上海吉瑪制藥技術有限公司；陽離子脂質體轉染試劑Lipofectamine 3000，美國Invitrogen 公司；藻藍蛋白由內蒙古農業(yè)大學惠贈；1%青霉素-鏈霉素、吉姆薩染液，美國Corning 公司；DMEM 細胞培養(yǎng)基、Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、96 孔板、6 孔板，美國Gibco 公司；胎牛血清，天津康源生物技術公司；FastQuant cDNA 第一鏈合成試劑盒、SuperReal 熒光定量預混試劑增強版，天根生物技術（北京） 有限公司；Mouse anti-β-Actin，Rabbit anti-RIPK1，Rabbit anti-MMP2，美國Cell Signaling Technology 公司；RIPA 細胞裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑，北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

BioSpectrum 凝膠成像儀，美國UVP 公司；超凈工作臺，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；漩渦振蕩器，德國IKA 公司；BSA224S 型數(shù)字電子天平，德國Sartorius 公司；CFX96 Touch qPCR 檢測系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；SpectraMax i3 連續(xù)波長多功能酶標儀，美國MD 公司；流式細胞儀FACSJAZZ，美國BD 公司；恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱，德國Heraeus 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人類非小細胞肺癌A549 細胞培養(yǎng)于T 25 的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)基為10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37 ℃，5%CO2。

1.3.2 細胞轉染 經(jīng)預試驗采用100 nmol/L 濃度轉染細胞，首先用DEPC 水將RIPK1-siRNA，陰性對照siRNA 提前配制成濃度為20 μmol/L 的儲存液備用。提前1 d 將細胞均勻的鋪在96 孔板、6 孔板、60 mm 的培養(yǎng)皿中，確保第2 天轉染時細胞的匯合度為70%，轉染時先將RIPK1 siRNA，陰性對照溶于Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基中，同樣將陽離子脂質體轉染試劑Lipofectamine 3000 溶于Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基中，將二者輕柔混勻室溫孵育10 min，將轉染復合物均勻滴加在細胞中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 換液，48～72 h 后做相關試驗。

1.3.3 MTT 法檢測肺癌A549 細胞體外生長情況收集對數(shù)生長期的細胞，血球計數(shù)板計數(shù)后以每孔5 000 個的細胞量鋪于96 孔板中，細胞貼壁生長后添加4.8 μmol/L 純品藻藍蛋白，并加入10 μL MTT，4～6 h 后加入SDS-HCl 裂解液，12 h 后測定波長570 nm 處的吸光值。連續(xù)測定5～6 d，記錄數(shù)據(jù)。

將轉染RIPK1 siRNA，陰性對照的細胞培養(yǎng)24 h，胰酶消化后同樣以每孔5 000 個細胞量均勻鋪于96 孔板中，待細胞貼壁后加入混有10 μL MTT 的培養(yǎng)基，4～6 h 后加入100 μL SDS-HCl 裂解液，12～16 h 后測定波長570 nm 處吸光值。同樣操作連續(xù)測定5～6 d，記錄試驗數(shù)據(jù)并繪制細胞生長曲線。

1.3.4 克隆形成試驗檢測肺癌A549 細胞的集落形成能力 將處于對數(shù)生長期的細胞鋪到6 孔板中，每孔細胞數(shù)為200 個，待24 h 細胞貼壁生長后，加入濃度為4.8 μmol/L 的純品藻藍蛋白的全培養(yǎng)基培養(yǎng)1～3 周，當克隆數(shù)約50 個時，使用吉姆薩染液對集落染色，統(tǒng)計細胞克隆數(shù)。

同樣，將轉染RIPK1 siRNA，陰性對照24 h后的細胞按以上操作處理。

1.3.5 流式細胞術檢測肺癌A549 細胞周期 收集轉染48 h 的A549 細胞，200 μL PBS 重懸細胞，用1 mL 注射器將細胞均勻緩慢的打到4 ℃預冷的70%酒精中，盡量使細胞單個分散，4 ℃固定24 h 以上。收集固定的細胞，用4 ℃預冷的PBS 洗細胞2 次，洗凈殘留的70%酒精，在每個樣品中添加終質量濃度為50 μg/mL 的RNase，37 ℃消化40 min，加入碘化丙啶（PI）于4 ℃避光染色30 min 后上機檢測。

1.3.6 劃痕試驗檢測A549 細胞遷移情況 轉染待細胞匯合度達到100%后用藍槍頭劃出劃痕，培養(yǎng)基洗去細胞碎片，于24 h 和48 h 分別對同一位置拍照，并計算遷移率。

1.3.7 熒光定量PCR 檢測相關基因mRNA 表達水平 收集用于試驗的細胞，利用Trizol 法提取細胞總RNA。根據(jù)試劑盒反轉錄為cDNA。熒光定量PCR 采用3 步法，擴增引物序列如下表1所示。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 The primer sequences of qRT-PCR

1.3.8 免疫印跡試驗檢測蛋白質的表達水平 收集藻藍蛋白處理的細胞和轉染48 h 的細胞，利用RIPA 裂解液提取細胞全蛋白，Bradford 法測定蛋白質濃度。將提取的蛋白中加入6×蛋白質上樣緩沖液，煮10 min 后吹打混勻，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉膜、封閉、一抗孵育過夜、二抗孵育等操作后，利用發(fā)光液顯色，帶有目的條帶的膠片經(jīng)洗片機顯影定影后，經(jīng)掃描儀掃描拍照保存。

2 結果與分析

2.1 藻藍蛋白對A549 細胞的體外增殖能力的影響

圖1為4.8 μmol/L 的藻藍蛋白處理A549 細胞后的細胞生長曲線，由圖1可以看出，試驗組從第2 天開始生長速率降低，第4 天以后生長速率受到顯著抑制。以上結果表明，藻藍蛋白對肺癌A549 細胞的生長在一定程度上有抑制作用。

2.2 藻藍蛋白對A549 細胞集落形成能力的影響

為了探究藻藍蛋白對肺癌A549 細胞的克隆形成能力的影響，將4.8 μmol/L 的藻藍蛋白處理的細胞接種到6 孔板中培養(yǎng)2～3 周，觀察集落形成情況，圖2顯示，高濃度的藻藍蛋白處理細胞后，細胞的集落數(shù)減少，克隆形成能力變弱。以上結果可以表明藻藍蛋白抑制了細胞的集落形成能力。

圖1 藻藍蛋白對A549 細胞的體外增殖能力的影響Fig.1 The effects of C-phycocyanin on the in vitro enhancement of A549 cells

2.3 藻藍蛋白對A549 細胞體外遷移能力的影響

劃痕試驗結果如圖3a所示，4.8 μmol/L 劑量的藻藍蛋白作用于肺癌A549 細胞使其體外遷移能力減弱，顯微鏡拍照劃痕結果可知試驗組在劃痕24，48 h 后向劃痕中央遷移的距離大于對照組，經(jīng)統(tǒng)計，遷移率如圖3b所示，遷移率顯著減小。以上說明藻藍蛋白能抑制肺癌A549 細胞的體外遷移能力。

圖2 藻藍蛋白對A549 細胞集落形成能力的影響Fig.2 The effects of C-phycocyanin on colony forming ability of A549 cells

圖3 藻藍蛋白對A549 細胞的體外遷移能力的影響Fig.3 The effects of C-phycocyanin on the migration in vitro of A549 cells

2.4 通過轉錄組學的測序分析篩選得到RIPK1差異基因

為了進一步探究藻藍蛋白影響A549 細胞的調控機制，采用高通量轉錄組技術對藻藍蛋白處理前后的細胞進行了差異基因的篩選，共篩選出了2 970 個差異表達基因 （其中1 539 個上調基因，1 431 個下調基因）。隨后對差異基因進行了KEGG 通路富集分析。圖4顯示，與腫瘤細胞增殖以及腫瘤發(fā)生相關的TNF，NF-κB，Wnt 等多種信號通路均有顯著富集，進一步提示藻藍蛋白抑制肺癌A549 細胞的增殖的機制可能與抑制這些信號通路活性相關。

本文篩選了與NF-κB 信號通路相關的差異表達基因，其中包括可能調控NF-κB 的關鍵上游基因受體相互作用蛋白激酶1（Receptor interacting proteinkinase1，RIPK1），轉錄組分析結果顯示RIPK1 在藻藍蛋白處理后出現(xiàn)顯著下調，推測藻藍蛋白能夠通過下調RIPK1 的表達而抑制A549細胞增殖。

2.5 檢測轉染小干擾RNA 沉默RIPK1 沉默效率

采用RNAi 技術特異性沉默RIPK1 的表達，觀察RIPK1 沉默后肺癌A549 細胞增殖和體外遷移能力。圖5顯示了熒光定量PCR、免疫印跡法驗證RIPK1 的沉默效果，由圖5可知，siRNA 的轉染使A549 細胞RIPK1 的基因及蛋白表達水平均受到明顯抑制，以上結果可以充分說明所設計的siRNA 能有效沉默RIPK1，可以進行后續(xù)試驗。

圖4 差異表達基因KEGG 富集柱狀圖Fig.4 Enrichment histogram of KEGG differentially expressed gene

圖5 轉染小干擾RNA 沉默RIPK1 檢測沉默效率Fig.5 The silencing efficiency was detected by the small interfering RNA silencing RIPK1

2.6 沉默RIPK1 對A549 細胞體外增殖能力的影響

接下來對沉默RIPK1 后的細胞表型進行了探究。圖6顯示了A549 細胞轉染RIPK1 siRNA，Neg.siRNA 后的生長曲線。結果表明，從轉染后的第1 天開始試驗組細胞的生長就受到抑制，并且隨著時間增加，抑制效果更加明顯。以上結果初步證實了沉默RIPK1 的表達可抑制A549 細胞的生長。

2.7 沉默RIPK1 對A549 細胞集落形成能力的影響

圖6 沉默RIPK1 對A549 細胞體外增殖能力的影響Fig.6 The effects of silencing RIPK1 on the in vitro proliferation of A549 cells

為了驗證RIPK1 對A549 細胞的集落形成能力的影響，將轉染的細胞進行克隆形成試驗。由圖7可知，沉默RIPK1 組細胞克隆形成數(shù)顯著減少，表明肺癌A549 細胞的集落形成能力減弱，提示沉默RIPK1 降低了肺癌A549 細胞的獨立生存能力，該結果與藻藍蛋白處理結果一致，進一步說明藻藍蛋白能夠通過下調RIPK1 的表達抑制A549細胞的增殖。

圖7 沉默RIPK1 對A549 細胞集落形成能力的影響Fig.7 The effects of silencing RIPK1 on colony forming ability of A549 cells

2.8 沉默RIPK1 對A549 細胞周期分布的影響

由細胞的生長和集落形成能力相關試驗可知，沉默RIPK1 對細胞的增殖有一定抑制作用。實驗室前期研究結果表明，藻藍蛋白能夠使A549細胞阻滯在G1 期，從而無法正常合成DNA，抑制細胞增殖[4]。為了進一步探究沉默RIPK1 后對肺癌A549 細胞周期分布的影響，采用流式細胞術測定細胞內DNA 含量，并對細胞周期進行分析。圖8顯示，與對照組相比，RIPK1 沉默后，細胞G1 期所占的比例顯著增加，細胞周期被阻滯在了G1期。這與藻藍蛋白處理A549 細胞的結果一致。

圖8 沉默RIPK1 對A549 細胞周期分布的影響Fig.8 The effects of silencing RIPK1 on the cycle distribution of A549 cells

細胞周期的每一個階段都受到一個保守的血清素/蘇氨酸蛋白激酶家族的CDKs 和周期蛋白家族Cyclin 的嚴格調控，CDKs-cyclin 復合體是細胞周期進程的中心調控因子，CyclinE-CDK2 復合體能調節(jié)晚期G1 期和早期S 階段DNA 合成的誘導，對細胞G1/S 轉換至關重要。隨著細胞周期的發(fā)展，CyclinA 取代了CyclinE 與CDK2 形成復合體，然后在S 期控制DNA 合成和復制。同時周期抑制因子P27 作用于CDK2，共同調控細胞周期[20-23]。圖9為熒光定量PCR 檢測周期基因表達圖，結果顯示，沉默RIPK1 后，CyclinA，CyclinE，CDK2 表達下調顯著，同時周期抑制因子P27 表達上調，表明藻藍蛋白可以通過下調RIPK1 表達而抑制肺癌A549 細胞的增殖。

2.9 沉默RIPK1 對A549 細胞體外遷移能力的影響

圖9 A549 細胞沉默RIPK1 對周期相關基因表達水平的影響Fig.9 The effects of silencing RIPK1 on the expression level of cyclone-related genes of A549 cells

將A549 細胞鋪在6 孔板中過夜培養(yǎng)，第2 天當細胞匯合度達到70%時進行細胞轉染，培養(yǎng)至細胞匯合度為100%時，劃出劃痕，如圖10a，對劃痕同一位置分別在24，48，72 h 拍照，觀察劃痕寬度變化，結果顯示，轉染RIPK1 siRNA 組劃痕寬度大于2 個對照組，即試驗組遷移率顯著小于對照組（圖10b）。

圖10 沉默RIPK1 對A549 細胞的體外遷移能力的影響Fig.10 The effects of silencing RIPK1 on the migration in vitro of A549 cells

采用免疫印跡試驗進一步驗證A549 細胞遷移能力。顯示沉默RIPK1 使細胞MMP2 蛋白表達水平下調，表明沉默RIPK1 可抑制A549細胞的體外遷移能力。

3 討論與結論

圖11 A549 細胞沉默RIPK1 對遷移蛋白表達水平的影響Fig.11 The effect of silencing RIPK1 on the expression level of migration of protein of A549 cells

本文以非小細胞肺癌A549 細胞系為模型，探究藻藍蛋白抗肺癌增殖的機制。首先采用4.8 μmol/L 劑量的藻藍蛋白處理A549 細胞，結果顯示藻藍蛋白能顯著降低細胞存活率和生長速率，降低細胞克隆形成能力和細胞體外遷移能力。為了進一步研究藻藍蛋白調控細胞增殖的機制，采用高通量測序技術，對藻藍色素蛋白處理前后的A549 細胞進行轉錄組差異分析，發(fā)現(xiàn)所涉及的基因主要參與細胞增殖、遷移、凋亡過程，尤其是與NF-κB 信號通路相關，并成功篩選出差異基因受體相互作用蛋白激酶1，利用RNAi 技術沉默RIPK1，在轉錄水平和蛋白水平上檢測沉默效果。與轉染Neg.siRNA 組相比，基因表達量下調到0.28，免疫印跡結果也顯示蛋白表達顯著下調。轉染細胞的生長曲線、細胞周期以及劃痕遷移率試驗的結果顯示，沉默RIPK1 后，細胞生長速率顯著降低，集落形成能力減弱，細胞周期阻滯在G1期，體外遷移能力減弱，與藻藍蛋白處理A549 細胞的表型相同。因此，本研究表明藻藍色素蛋白能夠通過下調RIPK1 表達抑制非小細胞肺癌A549的增殖，為進一步揭示藻藍色素蛋白抗肺癌細胞增殖的機制奠定了基礎。