李欣燃，田茹玉，陳勝賢，張華興

（六盤水師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水 553004）

0 引言

黃酮類化合物（Flavonoids） 又稱黃酮體，屬于多酚類物質(zhì)，在自然界中廣泛存在，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗衰老、抗腫瘤、清熱解毒、調(diào)節(jié)血脂和鎮(zhèn)靜等多種生物活性及保健功能[1-4]。用藥歷史達(dá)600 余年的銀杏葉具有多種藥理作用[5]，而黃酮是銀杏葉中主要的生物活性成分之一，其在銀杏葉中的含量是銀杏葉采摘的重要指標(biāo)。目前，對(duì)銀杏葉中黃酮相關(guān)研究報(bào)道較多[6-7]，銀杏葉也被公認(rèn)為黃酮含量較多的植物，同時(shí)也是黃酮類化合物主要提取原料之一。

刺梨是繅絲花（Rosa Rosa roxburghiif.roxburghii） 的別名，又名黃金果或刺梨子，屬于薔薇科薔薇屬落葉灌木，主要分布于貴州、云南、四川等地，其中以貴州居多[8]?，F(xiàn)代研究表明，刺梨具有延緩衰老[9]、抗腫瘤[10]、抗細(xì)胞凋亡和自噬[11-12]和延緩腎臟纖維化[13]等多種生物學(xué)活性，其所含有的黃酮類化合物是其發(fā)揮生物學(xué)活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[14-16]。目前，對(duì)于刺梨葉的化學(xué)成分已有相關(guān)報(bào)道，而對(duì)于其生物活性的研究相對(duì)較少。盡管已有研究證明刺梨葉中含有豐富的黃酮類化合物，但是對(duì)于其含量還未有一個(gè)相對(duì)比較的標(biāo)準(zhǔn)。至于刺梨桿，其化學(xué)成分及生物活性更是未見報(bào)道。刺梨葉、刺梨桿在刺梨的培育過程中多作為廢棄物處理，為探明刺梨葉、刺梨桿中總黃酮含量，確定刺梨葉、刺梨桿進(jìn)一步的開發(fā)利用價(jià)值，以銀杏葉、桿為參照，對(duì)刺梨葉、桿中黃酮含量進(jìn)行檢測分析，旨在為進(jìn)一步開展刺梨葉、桿有效成分生物活性分析積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

銀杏葉、銀杏桿、刺梨葉、刺梨桿，均采自貴州省六盤水市六盤水師范學(xué)院，采摘后通風(fēng)放置1 周，于80 ℃下烘干備用。

1.2 測定樣品液制備

將烘干處理后的銀杏葉、銀杏桿、刺梨葉、刺梨桿分別置于研缽中研至粉末，精確稱取各樣品1 g，按料液比1∶50 加入80%乙醇，放置80 ℃水浴鍋中加熱2 h，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min 離心10min，取上清液待測。

1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制備

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg 于50 mL 容量瓶中，加入80%乙醇定容，搖勻，使其完全溶解，即得0.2 g/L 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液；取10，8，6，4，2 mL 于25 mL 容量瓶中，加80%乙醇至10 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻后，放置室溫6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻后，室溫放置6 min，加入4% NaOH 溶液10 mL，用80%乙醇溶液稀釋至25 mL，得蘆丁對(duì)照液，放置室溫15 min，于波長510 nm 處測其吸光度。

1.4 總黃酮含量檢測

采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法[17]，測得各提取液中黃酮含量，分別取4 種待測液各1 mL，置于25 mL 容量瓶中，加入80%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置室溫6 min；加10% Al(NO3)3溶液1 mL，混勻后室溫放置6 min；加4% NaOH 溶液10 mL，以80%乙醇定容至25 mL，混勻，放置室溫15 min，于吸光度最大的510 nm 處測定其吸光度，每個(gè)樣品重復(fù)測定3 次，取平均值，計(jì)算總黃酮含量。

1.5 精密度和重復(fù)性試驗(yàn)

制備刺梨葉總黃酮提取液，平行試驗(yàn)5 份，按照Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法檢測計(jì)算總黃酮含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），每份樣品重復(fù)測定5 次。

1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取刺梨葉總黃酮提取液，檢測時(shí)間為提取后0和30 min，按照Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法測定其吸光度，重復(fù)5 次，計(jì)算分析其總黃酮含量的變化。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Prism5 軟件，各組樣品中總黃酮含量采用配對(duì)T 檢驗(yàn)法進(jìn)行分析，若p 值≤0.05，則表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以吸光度為縱坐標(biāo)Y，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。并進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程：Y=1.301X+0.050，R2=0.990。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，蘆丁溶液質(zhì)量濃度為0.2～0.8 mg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 不同樣品中總黃酮提取含量比較

不同樣品中總黃酮含量的比較見表1。

表1 不同樣品中總黃酮含量的比較/mg·g-1

由表1 可知，刺梨葉、桿樣品與銀杏葉、桿樣品中黃酮含量差異顯著，變化幅度從1.91 mg/g 至9.87 mg/g，其中刺梨葉和刺梨桿提取液中總黃酮含量較高，分別為9.87 mg/g 和9.08 mg/g，銀杏桿中黃酮含量最低，僅為1.91 mg/g。

不同部位黃酮含量見圖2。

圖2 不同部位黃酮含量

由圖2 可知，刺梨的各部分總黃酮含量顯著高于銀杏相應(yīng)部位含量，且p＜0.001；刺梨葉和刺梨桿總黃酮含量無顯著性差異；刺梨桿總黃酮含量顯著高于銀杏葉黃酮含量，p＜0.05；而銀杏葉總黃酮含量顯著高于其桿部黃酮含量，p＜0.001。

2.3 精確度和重復(fù)性檢測結(jié)果

取刺梨葉提取其總黃酮含量，做5 個(gè)平行試驗(yàn)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.47% ，說明采用Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法測定樣品總黃酮含量的方法可行性好、精確度高、重復(fù)性好。

精確度和重復(fù)性檢測結(jié)果見表2。

表2 精確度和重復(fù)性檢測結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性檢測結(jié)果

將刺梨葉總黃酮提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后于室溫放置30 min，分別測定0 和30 min 后刺梨葉總黃酮提取液含量。再將提取液于4 ℃放置30 min 后，刺梨葉中提取的總黃酮含量明顯降低為原來的85.67%，提取液中黃酮含量下降差異顯著（見圖3），表明提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后穩(wěn)定性較差，試驗(yàn)中需盡快完成檢測。

穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3，刺梨葉總黃酮提取液穩(wěn)定性檢測見圖3。

表3 穩(wěn)定性檢測結(jié)果

圖3 刺梨葉總黃酮提取液穩(wěn)定性檢測

3 結(jié)論

黃酮類化合物是植物體內(nèi)重要的代謝產(chǎn)物，對(duì)人體健康具有重要價(jià)值[18-19]。為此，尋找黃酮含量豐富的植物體對(duì)其進(jìn)行生物活性研究已是國內(nèi)外科學(xué)工作者的研究熱點(diǎn)之一。刺梨首載于《本草綱目拾遺》[20]，屬于傳統(tǒng)中藥，具有多種藥理作用。已有研究證明刺梨果中含有豐富的黃酮類化合物，而且這類物質(zhì)是刺梨果發(fā)揮生物活性的基礎(chǔ)成分之一。鑒于此，推測刺梨的葉和桿中應(yīng)含有豐富的黃酮類物質(zhì)，研究目的之一即是探明刺梨葉和桿中黃酮化合物含量。銀杏葉因其多種藥理作用而被人所重視，并已得到很好的研究開發(fā)應(yīng)用，其中黃酮即是銀杏葉發(fā)揮藥理活性的主要有效成分之一，同時(shí)在銀杏葉中，黃酮化合物含量高也為人所熟知。以銀杏葉為參照，對(duì)銀杏桿、刺梨葉、刺梨桿中黃酮含量進(jìn)行檢測，以期確定銀杏桿、刺梨葉和刺梨桿的開發(fā)利用價(jià)值。

采用紫外分光光度比色法，分別對(duì)銀杏葉、銀杏桿、刺梨葉和刺梨桿中總黃酮含量進(jìn)行測定。此方法操作及樣品處理相對(duì)簡便，精密度高、重復(fù)性好[17，21]，可方便快速地對(duì)銀杏及刺梨葉和桿中總黃酮含量進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于銀杏而言，葉片中黃酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于桿中黃酮含量，說明銀杏桿的開發(fā)利用價(jià)值不高；而對(duì)于刺梨，葉片和桿之間的黃酮含量差異不大，同時(shí)其黃酮含量顯著高于銀杏葉中黃酮含量，說明刺梨的葉、桿均具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。