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響應(yīng)面法優(yōu)化低溫水提薏苡仁糖蛋白的制備及理化特性的研究*

2020-11-14 08:28鄭文宇林維杰楊容楊土娣李靜廖蘭
福建輕紡 2020年11期
關(guān)鍵詞:糖蛋白回歸方程樣品

鄭文宇,林維杰,楊容,楊土娣,李靜,廖蘭,

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 300134;2.福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院,福建 福州 350102)

薏苡仁具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖和調(diào)血脂等藥理活性作用[1]。李時(shí)珍在《本草綱目》稱(chēng)其為上品養(yǎng)心藥。薏苡仁含淀粉60%~65%、多糖5.28%、蛋白質(zhì)18.31%、脂肪5.61%[2],還含豐富的B族維生素和磷、鐵、鈣、鋅、鉀等多種礦物質(zhì)。薏苡仁結(jié)構(gòu)緊密,淀粉含量高,水溶性較差,生物活性物質(zhì)提取率較低且易產(chǎn)生回生、老化和沉淀的現(xiàn)象,導(dǎo)致其難以消化,一定程度限制了其開(kāi)發(fā)利用。

目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已就薏苡仁酯、多糖、脂類(lèi)等的化學(xué)成分和功能作用進(jìn)行了深入研究[3],但對(duì)其蛋白類(lèi)活性物質(zhì)的研究有限,特別是其糖蛋白組分的研究缺乏。張怡等[4]通過(guò)石油醚脫脂和水提乙醇、丙酮、乙醚沉法制備糖蛋白粗品,杜曉旭[5]通過(guò)熱水浸提和Sevag法制備薏苡仁糖蛋白粗品。由于缺乏高純度樣品,目前薏苡仁糖蛋白的研究局限于提升薏苡仁糖蛋白得率的手段、分離純化方式等方面,缺乏深入薏苡仁糖蛋白高純度活性構(gòu)效關(guān)系的研究。本文以響應(yīng)面法優(yōu)化低溫水提法的制備較高純度的薏苡仁糖蛋白,并對(duì)其理化特性進(jìn)行研究,為后續(xù)O-糖鏈釋放前后對(duì)于薏苡仁糖蛋白活性構(gòu)效關(guān)系的研究提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

薏苡仁,白殼種,購(gòu)自福建南平浦城集貿(mào)市場(chǎng);

三氯甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、菲咯嗪,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

電子天平(ML204):梅特勒-托利儀器有限公司;

高速組織勻漿機(jī)(PT 2100):寶創(chuàng)科技股份有限公司;

高速冷凍離心機(jī)(TGL-20MB):長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)有限公司;

高速分散均質(zhì)機(jī)(FM200):廈門(mén)精藝業(yè)主科技有限公司;

實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(EL20 ):梅特勒-托利多儀器有限公司;

傅里葉紅外光譜儀(Nicolet):美國(guó)尼高力儀器公司 ;

酶標(biāo)儀(Spark-10M):帝肯上海貿(mào)易有限公司;

冷凍干燥機(jī)(FD-1C-50):北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)處理

將薏苡仁打粉過(guò)80目篩,配制成20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))懸浮液,30 ℃恒溫水化12 h。高壓均質(zhì)20 MPa、3次,冷凍干燥制樣,密封陰涼干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 薏苡仁糖蛋白提取精制工藝流程

薏苡仁凍干粉→水提法(控制料液比、時(shí)間、溫度)→離心→過(guò)濾→蒸發(fā)濃縮→Sevag法脫除游離蛋白質(zhì)→無(wú)水乙醇沉淀→溶解、透析→真空冷凍干燥→薏苡仁糖蛋白精制品(CSGP)

⑴ Sevage法脫除游離蛋白:薏苡仁糖蛋白濃縮液加入Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=3∶1[體積分?jǐn)?shù)]),其中薏苡仁糖蛋白濃縮液與Sevage試劑比例為4∶1(體積分?jǐn)?shù)),磁力攪拌40 min,脫除游離蛋白質(zhì),離心取上清液,重復(fù)上述操作4~5次。

⑵ 醇沉:取上清液以1∶4(體積分?jǐn)?shù))的比例加入95%乙醇,磁力攪拌35 min,密封包裝置于4 ℃冰箱中放置12 h,10,000 r/min離心30 min,收集沉淀為薏苡仁糖蛋白粗品。

⑶ 透析:將薏苡仁糖蛋白粗品溶于水中,裝入截留分子量為8,000~14,000 Da的透析袋內(nèi),流動(dòng)的自來(lái)水透析處理48 h,收集透析袋內(nèi)的液體,冷凍干燥得薏苡仁糖蛋白精制品(CSGP)。

1.2.3 薏苡仁糖蛋白含量的測(cè)定

采用王應(yīng)強(qiáng)[6]的苯酚-硫酸法方法稍作修改,具體方法如下:

⑴ 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,加水定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

⑵ 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:準(zhǔn)備6支帶塞試管,移入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。加入水補(bǔ)足至1.0 mL,移取1.0 mL苯酚溶液,立即移入濃硫酸5.0 mL。靜置20 min,使苯酚和硫酸充分反應(yīng),振蕩均勻,混合。放置于30 ℃的水浴中,恒溫反應(yīng)20 min。建立對(duì)照,確定490 nm處吸光度,平行測(cè)定3次,取平均值。以葡萄糖濃度和吸光度為水平坐標(biāo)和垂直坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立線性回歸方程。

⑷ 換算因子f的確定:根據(jù)陳雙[7]的方法稍作修改,準(zhǔn)確稱(chēng)量薏苡仁糖蛋白粗品10 mg,用蒸餾水定容至100 mL,配制成0.1 mg/mL的溶液,搖勻后靜置存放。準(zhǔn)確吸取1 mL 0.1 g/L的薏苡仁糖蛋白粗品溶液,按本章2.3.2.1的處理步驟進(jìn)行操作,測(cè)出吸光值A(chǔ),代入回歸方程A=12.9C+0.0037,R2=0.9996中,計(jì)算出薏苡仁糖蛋白粗品中葡萄糖的濃度和理論薏苡仁糖蛋白質(zhì)量M(mg),重復(fù)3次操作,測(cè)定3次結(jié)果,取平均值記為M=0.05169 mg;記實(shí)際薏苡仁糖蛋白質(zhì)量m0(mg),換算因子計(jì)算結(jié)果為f=m0/M=1.93471;薏苡仁糖蛋白含量的計(jì)算公式為C=(A-0.0037)×n×f/12.9,其中A為樣品的吸光值,C為樣品濃度(mg/mL),n為稀釋倍數(shù),f為換算因子。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1 料液比對(duì)薏苡仁糖蛋白得率的影響

取6個(gè)25 mL錐形瓶,稱(chēng)量樣品0.5 g/個(gè),將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出,在恒溫水浴振蕩器中水化提取,按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14,溫度35 ℃,反應(yīng)時(shí)間3 h,進(jìn)行不同料液比下的單因素實(shí)驗(yàn),設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性的影響

取6個(gè)25 mL錐形瓶,稱(chēng)取樣品0.5 g/個(gè),將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出,在恒溫水浴振蕩器中水化提取,按每小時(shí)取一次樣,溫度35 ℃,料液比1∶10,進(jìn)行不同提取時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn),設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 提取溫度對(duì)薏苡仁糖蛋白得率的影響

取6個(gè)25 mL錐形瓶,稱(chēng)取樣品0.5 g/個(gè),將裝有配制好的樣品用保鮮膜塑封瓶口防止濺出,在恒溫水浴振蕩器中水化提取,按20~45 ℃每5 ℃,料液比1∶10,反應(yīng)時(shí)間3 h,進(jìn)行不同溫度下的單因素實(shí)驗(yàn),設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理,以薏苡仁糖蛋白得率(Y)為響應(yīng)指標(biāo),選取提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為響應(yīng)因子,進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),確定抗氧化肽制備的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.5 薏苡仁糖蛋白(CSGP)O-糖鏈釋放產(chǎn)物(DCSGP)的制備

根據(jù)Zheng等[7]人的方法稍作修改,取1.0 mg CSGP溶解于10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中,反應(yīng)在55 ℃進(jìn)行6 h,使O-糖鏈釋放(發(fā)生β-消除反應(yīng)),得到產(chǎn)物記為DCSGP。

1.6 薏苡仁糖蛋白O-糖鏈釋放前后的理化性質(zhì)測(cè)定

1.6.1 CSGP、DCSGP蛋白質(zhì)含量和糖含量測(cè)定

根據(jù)杜曉旭等[8]人的方法稍作修改:采用凱氏定氮法和苯酚-硫酸法。

1.6.2 CSGP、DCSGP定性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)李婷婷等[9]、Guo等[10]和Yun等[11]人的方法稍作修改,對(duì)顏色、狀態(tài)、溶解性、雙縮脲反應(yīng)、280 nm處吸收、CTAB絡(luò)合反應(yīng)、I2-KI反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,采用Excel 2007對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差,Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖,采用SPSS(p<0.05)比較平均值之間的差異性并進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比的確定

由圖1可以看出,隨著水用量的增加,薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降,在料液比1∶10 g/mL時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)料液比過(guò)低,水量少,溶液過(guò)飽和,薏苡仁糖蛋白溶解不充分;隨著用水量的增加,薏苡仁糖蛋白溶解度逐漸上升。當(dāng)料液比過(guò)大,能耗隨之加大,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的損失加大,使薏苡仁糖蛋白提取率下降。

2.2.2 提取溫度的確定

提取溫度對(duì)薏苡仁糖蛋白得率的影響如圖2所示。薏苡仁淀粉60 ℃會(huì)發(fā)生糊化,溶于水并與其他水溶性物質(zhì)同時(shí)溶出,因此,低溫提取對(duì)于提高薏苡仁糖蛋白得率是一個(gè)比較重要的因素。由圖2可以看出,隨著溫度的升高,薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降,在25 ℃時(shí)達(dá)到最佳。這可能是溫度升高,伴隨淀粉形成糊精的發(fā)生,阻礙薏苡仁糖蛋白溶出,此外過(guò)高的提取溫度會(huì)導(dǎo)致多糖生物活性的喪失。

2.2.3 時(shí)間的確定

由圖3可知,隨著時(shí)間的增加,薏苡仁糖蛋白得率先上升后下降,在3 h時(shí)達(dá)到最佳。提取時(shí)間過(guò)短,薏苡仁糖蛋白提取不完全;隨著提取時(shí)間的不斷增加,薏苡仁糖蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),可能是蛋白質(zhì)顆粒之間作用增強(qiáng),使蛋白質(zhì)易凝結(jié)而聚沉,引起糖蛋白結(jié)構(gòu)上的破壞和生物活性的失活。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

低溫水提薏苡仁糖蛋白的工藝優(yōu)化根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了17組實(shí)驗(yàn),5組為中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn),如表2所示。本實(shí)驗(yàn)以糖蛋白提取率作為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)IC50值Y進(jìn)行多元回歸擬合。得到二次多項(xiàng)式擬合方程為:

回歸模型的顯著性檢驗(yàn)和方差分析見(jiàn)表3,由表3可知,回歸方程極顯著(p<0.0001),失擬項(xiàng)不顯著(p=0.1098>0.05),模型擬合程度好;相關(guān)系數(shù)R2=0.9981>0.9,說(shuō)明模型滿(mǎn)足了99%的樣本空間;模型中的參數(shù)A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2都是顯著的(F<p<0.05),顯著參數(shù)超過(guò)三分之二;同時(shí)該模型的CV=1.29%,CV值低,置信度高,說(shuō)明模型方程能準(zhǔn)確地反應(yīng)實(shí)驗(yàn)值,說(shuō)明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系,可以通過(guò)該回歸方程確定低溫水提薏苡仁糖蛋白的最佳工藝條件。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析表

交互項(xiàng)AB、BC顯著,說(shuō)明提取時(shí)間和提取溫度、提取溫度和料液比有顯著的交互作用。根據(jù)回歸方程做出三維曲面圖及等高線圖,如圖4、圖5所示。固定提取時(shí)間,薏苡仁糖蛋白提取率隨提取溫度的增加先急劇增加后略有下降;固定提取溫度,薏苡仁糖蛋白提取率隨提取時(shí)間增加先增大后減小。固定提取溫度,薏苡仁糖蛋白提取率隨料液比的增加先急劇增加后略有下降;固定料液比,薏苡仁糖蛋白提取率隨提取溫度的增加先增大后減小,并且交互作用十分明顯。這與前面的回歸方程結(jié)果相吻合。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由Design Expert結(jié)果分析可知,薏苡仁糖蛋白最佳提取方案:料液比1∶9.72,提取溫度25.31 ℃、提取時(shí)間3.09 h,在此條件下,重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次得薏苡仁糖蛋白提取率(6.87±0.31)%,與預(yù)測(cè)值6.91%相差不大,表明響應(yīng)面模型優(yōu)化具有可行性。

2.5 薏苡仁糖蛋白O-糖鏈釋放前后的理化性質(zhì)分析

由表4可以得到:CSGP和DCSGP均易溶于水,不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。雙縮脲反應(yīng)和280 nm處吸收均為陽(yáng)性,說(shuō)明CSGP和DCSGP均含有蛋白質(zhì)。與CTAB反應(yīng)呈陽(yáng)性,與I2-KI反應(yīng)、斐林試劑反應(yīng)、FeCl3反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)均呈陰性,說(shuō)明CSGP為非淀粉類(lèi)酸性糖蛋白,DCSGP為非淀粉類(lèi)酸性糖和蛋白的混合物,均不含有還原糖、多酚、糖醛酸類(lèi)物質(zhì)。

表4 CSGP、DCSGP理化性質(zhì)

3 結(jié)論

采用低溫水提醇沉的方法制備了薏苡仁糖蛋白,通過(guò)控制料液比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素,以薏苡仁糖蛋白得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),得到薏苡仁糖蛋白提取率最佳體系條件為:料液比為1∶9.72 g/mL、提取時(shí)間為3.09 h、提取溫度為25.31 ℃,此條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次得薏苡仁糖蛋白提取率為(6.87±0.31)%,薏苡仁糖蛋白是非淀粉類(lèi)半結(jié)晶狀的酸性糖蛋白[糖含量(42.48±1.13)%、蛋白含量(27.15±1.30)%],不含有還原糖、多酚、糖醛酸類(lèi)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)可以為進(jìn)一步研究薏苡仁糖蛋白結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系和深度應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

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