孫國(guó)威，米 雪，周彥軍，魏孔斌，王 雅，馬文芳，李 軍

（1.蘭州十百農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，甘肅蘭州 730022；2.陜西科技大學(xué)，陜西西安 710021；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；4.蘭州市七里河區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化辦，甘肅 蘭州 730050；5.蘭州理工大學(xué)，甘肅 蘭州 730050）

0 引言

百合是百合科百合屬植物，百合植物的鱗莖既可食用、也可藥用，是我國(guó)首批的藥食兩用植物之一[1]。百合營(yíng)養(yǎng)豐富，其鱗莖主要含有多糖、皂苷、生物堿、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，另外還含有一些蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素、必需氨基酸和必需微量元素等基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。因此，既可利用其藥用價(jià)值，也可以發(fā)揮其營(yíng)養(yǎng)保健功能。

百合多糖是其主要功能性成分之一，藥理研究證明，其具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抑菌等[3-6]生理功能。以蘭州百合鱗莖為原料，采用酶解輔助法從百合中提取粗多糖，并進(jìn)行百合粗多糖止咳作用研究，最大限度地提高百合利用率，提高百合附加值，為百合的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百合干片，甘肅省輕工科學(xué)研究所提供；復(fù)合酶，和氏璧生物技術(shù)有限公司提供。

無(wú)水葡萄糖、無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸、無(wú)水亞硫酸氫鈉、氨水等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9030 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AL204 型電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；RE52CS-1 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；FDU-1200 型冷凍干燥機(jī)，上海愛(ài)郎儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將百合干片粉碎，裝袋備用。

1.3.2 百合多糖提取

5 g 百合干片→粉碎→脫脂→干燥→稱質(zhì)量→復(fù)合酶法提取→滅酶→抽濾→蒸發(fā)濃縮→醇沉→冷凍干燥→稱質(zhì)量→密封保藏。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酶添加量的選擇：固定料液比1∶15（g∶mL），提取時(shí)間30 min，提取溫度50 ℃，分別考查酶添加量在3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%的條件下對(duì)百合粗多糖得率的影響；料液比的選擇：固定酶添加量4%，提取時(shí)間30 min，提取溫度50 ℃，分別考查料液比在1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g∶mL） 的條件下對(duì)百合粗多糖得率的影響；提取時(shí)間的選擇：固定酶添加量4%，料液比1∶15（g∶mL），提取時(shí)間30 min，分別考查提取溫度在30，40，50，60，70 ℃的條件下對(duì)百合粗多糖得率的影響；提取溫度的選擇：固定酶添加量4%，料液比1∶15（g∶mL），提取溫度50 ℃，分別考查提取時(shí)間10，20，30，40，50 min 的條件下對(duì)百合粗多糖得率的影響。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定酶添加量為4%，選擇提取溫度、提取時(shí)間和料液比3 個(gè)因素，采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行三因素三水平的Boxbehnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 百合多糖止咳作用研究

（1） 百合多糖對(duì)SO2引咳小鼠的止咳作用。24 只小鼠雌雄各半，隨機(jī)分成4 組：空白組、陽(yáng)性對(duì)照組（可待因30 mg/kg/d）、百合粗多糖高、低劑量組（40，20 mg/kg/d），各組均灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)7 d，其中空白組給予等體積生理鹽水。于末次給藥1 h 后，用50%濃硫酸5 mL，滴加至盛有0.5 g 無(wú)水亞硫酸氫鈉的平板上，立即將1 L 的玻璃燒杯倒扣在平皿上，燒杯內(nèi)隨即產(chǎn)生SO2氣體。然后迅速將各組小鼠分別放入燒杯內(nèi)，觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期（小鼠放入至出現(xiàn)咳嗽的時(shí)間），以及開(kāi)始咳嗽后3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)，其中以小鼠出現(xiàn)明顯的張口喘息為咳嗽指標(biāo)。

（2） 百合多糖對(duì)氨水引咳小鼠的止咳作用。24 只小鼠雌雄各半，隨機(jī)分成4 組：空白組、陽(yáng)性對(duì)照組（可待因30 mg/kg/d）、百合粗多糖高、低劑量組（40，20 mg/kg/d），各組均灌胃給藥，每日1 次，連續(xù)7 d，其中空白組給予等體積生理鹽水。于末次給藥1 h 后，將小鼠分別置于1 L 倒置的玻璃燒杯中，通過(guò)霧化器從燒杯底部小口處通入25%的氨水15 s，觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期（小鼠放入至出現(xiàn)咳嗽的時(shí)間），以及開(kāi)始咳嗽后3 min 內(nèi)的咳嗽次數(shù)，其中以小鼠出現(xiàn)明顯的張口喘息為咳嗽指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酶添加量對(duì)百合多糖得率的影響

酶添加量對(duì)百合多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

隨著酶添加量的增加，復(fù)合酶與底物的接觸面積增加，致使多糖能夠更快地分離出來(lái)，當(dāng)酶添加量大于4%時(shí)，得率上升趨勢(shì)逐漸趨于平緩，說(shuō)明酶添加量達(dá)到4%時(shí)，酶與底物的反應(yīng)逐漸趨于飽和，再增加酶的添加量，得率變化反而不大。因此，酶的最適添加量為4%。

2.1.2 提取溫度對(duì)百合多糖得率的影響

提取溫度對(duì)百合多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

酶都需要在最適溫度條件下才能表現(xiàn)出較高的活性，由圖2 可知，百合多糖得率隨著溫度的增長(zhǎng)不斷升高，在50 ℃時(shí)得率達(dá)到最大21.2%，說(shuō)明此時(shí)可能是復(fù)合酶的最適溫度，但之后隨著溫度的升高，復(fù)合酶活力逐漸降低，直至失活，百合多糖得率也逐漸降低。因此，最適酶解溫度為50 ℃。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)百合多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，百合多糖得率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)30 min 時(shí)，百合多糖得率開(kāi)始下降。酶解時(shí)間太短，反應(yīng)不充分，多糖不能充分溶出，而當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值時(shí)，隨著酶促時(shí)間延長(zhǎng)，并不能增加多糖的得率，反而會(huì)使得率下降。因此，最佳提取時(shí)間為30 min。

2.1.4 料液比對(duì)百合多糖得率的影響

料液比對(duì)百合多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，料液比在1∶15～1∶35 時(shí)，隨著料液比的增加，百合多糖得率逐漸增大，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶25（g∶mL） 時(shí)，多糖得率開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，可能是由于料液比增大，酶與底物的接觸減小，酶解效果變差造成的。因此，最佳料液比為1∶25（g∶mL）。

2.2 百合多糖提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 Box-behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C） 進(jìn)行三因素三水平共17 組Box-behnken 響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

Box-behnken 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-behnken 中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)百合多糖提取試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以百合多糖得率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程為：

響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

由表3 可知，模型的p＜0.001，表示回歸方程差異極顯著，失擬項(xiàng)p 值為0.347 7，不顯著，說(shuō)明該模型能夠很好的擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)。回歸方程決定系數(shù)R2=0.964 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.919 8，表明回歸方程具有較好的擬合度。料液比的一次項(xiàng)達(dá)到了顯著水平，提取溫度的一次項(xiàng)達(dá)到了高度顯著。影響因素由大到小順序?yàn)樘崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間。此外，料液比和提取時(shí)間的交互作用，提取時(shí)間和提取溫度的交互作用也達(dá)到了顯著水平。料液比、提取時(shí)間和提取溫度的二次項(xiàng)均達(dá)到了高度顯著。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

響應(yīng)面曲面圖和等高線圖由Design Expert 8.0.6軟件繪制。

各因素交互作用對(duì)百合多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線圖見(jiàn)圖6。

經(jīng)Design Expert 軟件優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測(cè)百合多糖最佳提取工藝條件為料液比1∶25.57（g∶mL），提取時(shí)間30.92 min，提取溫度53.79 ℃。理論計(jì)算百合多糖的最佳得率為24.04%，考慮到實(shí)際操作的可行性和方便性，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶26（g∶mL），提取時(shí)間31 min，提取溫度54 ℃，并在該條件下進(jìn)行平行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得的得率為23.80%，預(yù)測(cè)值誤差為1.0%。

2.3 百合粗多糖對(duì)SO2 致咳小鼠的止咳作用評(píng)價(jià)

百合粗多糖對(duì)SO2引咳小鼠的影響（X±SD） 見(jiàn)表4。

表4 百合粗多糖對(duì)SO2 引咳小鼠的影響（X±SD）

由表4 可知，與空白對(duì)照組相比，高劑量百合粗多糖可顯著延長(zhǎng)SO2致咳小鼠的咳嗽潛伏期（p＜0.05）、明顯減少咳嗽次數(shù)，咳嗽抑制率為25.8%，止咳活性為46.5%。表明百合粗多糖具有一定的止咳作用。

2.4 百合粗多糖對(duì)氨水致咳小鼠的止咳作用評(píng)價(jià)

百合粗多糖對(duì)氨水引咳小鼠的影響（X±SD） 見(jiàn)見(jiàn)表5。

表5 百合粗多糖對(duì)氨水引咳小鼠的影響（X±SD）

由表5 可知，與空白對(duì)照組相比，高劑量百合粗多糖可顯著延長(zhǎng)氨水致咳小鼠的咳嗽潛伏期（p＜0.05）、減少咳嗽次數(shù)（p＜0.05），咳嗽抑制率為37.8%，止咳活性為67.2%。表明百合粗多糖具有一定的止咳作用。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法優(yōu)化出百合多糖提取的最佳工藝條件為料液比1∶26（g∶mL），提取時(shí)間31 min，提取溫度54 ℃。進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得得率為23.80%，與理論計(jì)算的百合多糖最大得率進(jìn)行比較，誤差僅為1%，說(shuō)明該模型具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。百合粗多糖對(duì)小鼠止咳試驗(yàn)結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，百合粗多糖高劑量組能夠延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期，縮短3 min 內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)，作用效果略低于陽(yáng)性對(duì)照組。說(shuō)明百合粗多糖可以改善咳嗽癥狀，具有止咳作用。