趙晨煊，李瑞婷

（廣州工商學(xué)院，廣東 廣州 510850）

生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以不斷產(chǎn)生自由基，抗氧化劑能捕獲并清除這些自由基，從而減少自由基對(duì)機(jī)體的損傷，具有類激素、降血壓、抗氧化、抗血栓、抗菌等生理活性功能[1]。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)食源性動(dòng)植物蛋白經(jīng)酶解后，分離純化得到的酶解產(chǎn)物具有抗氧化能力，且該能力來(lái)源于蛋白酶解產(chǎn)物中的多肽，如大豆多肽、玉米多肽等都逐漸受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

天然抗氧化肽主要來(lái)源于動(dòng)植物蛋白。動(dòng)物蛋白方面，尤其是從海洋食物中提取得到的抗氧化產(chǎn)品多以魚類為原料，提取出具有較強(qiáng)抗氧化活性的多肽。Wang Xueqin 等人[2]研究發(fā)現(xiàn)鯖魚蛋白水解物分離得到的分子量為1 644 kDa 的多肽具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力，并得出鯖魚蛋白水解物可作為抗氧化肽的原料。Siahoppsh A 等人[3]研究發(fā)現(xiàn)水解度為129.38 mg/mL 的虎斑烏賊胃蛋白酶提取物的FRAP 指標(biāo)是21.75 mg/mL，表明該提取物具有抗氧化活性，并推測(cè)該作用是烏賊器官中的蛋白質(zhì)經(jīng)水解后引起的。除此之外，其他動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源的抗氧化肽也是科學(xué)家研究的熱點(diǎn)，Chen Chen 等人[4]采用木瓜蛋白酶水解雞蛋白蛋白，并通過(guò)超濾、凝膠層析等方法得到2 段具有較強(qiáng)清除自由基能力的肽段，其系列為Tyr-Leu-Gly-Ala-Lys（551.54 Da） 和Gly-Gly-Leu-Glu-Pro-Ile-Asn-Phe-Gln（974.55 Da）。植物蛋白方面，近幾年對(duì)大豆蛋白中的抗氧化肽的研究甚多。吳建中[5]從5 種蛋白酶中篩選出木瓜蛋白酶水解之后的大豆蛋白具有較高的抗氧化性，采用Sephadex G-25 凝膠過(guò)濾層析和高效凝膠過(guò)濾色譜進(jìn)行分離，確認(rèn)分子量約1 100 Da 的多肽具有抗氧化活性的。徐力等人[6]以低溫冷榨豆粕為原料，對(duì)大豆蛋白的小分子酶解產(chǎn)物的抗氧活性進(jìn)行了研究，最終獲得了平均分子量800 Da 的小分子活性肽（SBP），并得知SBP 有與GSH 相似的抗氧化活性，即在活性肽終質(zhì)量濃度為8 mg/mL 時(shí)，對(duì)鄰苯三酚自氧化抑制率達(dá)到了70%。王可[7]研究發(fā)現(xiàn)玉米抗氧化肽也具有與GSH 同樣的抗氧化活性，組分CAPS-1 的質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，其對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)84.75%；由王琪[8]的研究得知，小麥胚芽蛋白的酶解及其產(chǎn)物經(jīng)脫鹽后，質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)其對(duì)DPPH 自由基清除率與抗壞血酸相似，可達(dá)80%。

文冠果是我國(guó)特有的木本食用油料樹(shù)種之一，分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、種植面積大。文冠果油粕是文冠果種仁制油剩余的副產(chǎn)品，產(chǎn)量大，多作為飼料。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，文冠果種仁蛋白質(zhì)中有17 種氨基酸且必需氨基酸的種類齊全，具有良好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[9-10]。鑒于油粕未得到充分利用，且綜合利用水平和經(jīng)濟(jì)效益低下。以文冠果油粕為原料，對(duì)文冠果油粕蛋白的酶解產(chǎn)物中活性肽的抗氧化性做出評(píng)價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料與化學(xué)試劑

文冠果油粕，市售；牛血清蛋白、考馬斯G-250、木瓜蛋白酶、1.1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、Tris-HCl 緩沖液、鄰苯三酚、重蒸水、谷胱甘肽GSH、Sephadex G-25 凝膠，北京科百奧試劑公司提供；抗氧化陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基測(cè)試盒、羥自由基測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；其他分析醇，由實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

高效冷凍離心機(jī)，Thermo Fisher SCIENTIFIC 產(chǎn)品；KDY-9830 型凱氏定氮儀，北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；全波段分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；1.6 cm×80 cm 層析柱，北京科百奧試劑公司產(chǎn)品；IHID-3 型紫外檢測(cè)儀、HD-A 型電腦采集器，上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；SENCO R-201 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；超濾Vivaflow 50、Omega 濾膜，德國(guó)Sartorious Stedim 產(chǎn)品；HH 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 文冠果油粕預(yù)處理

文冠果油粕經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過(guò)80 目標(biāo)準(zhǔn)篩，室溫下在石油醚中浸泡2 h（料液比為1∶4），以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，濾去上清液，沉淀物置于通風(fēng)櫥風(fēng)干并過(guò)夜，得到脫脂文冠果油粕。

1.4 傳統(tǒng)Osborne 法分級(jí)分離4 種蛋白

稱取經(jīng)預(yù)處理的油粕50 g，從其中提取4 種分類蛋白，方法參照文獻(xiàn)[11]，稍作改動(dòng)。

1.5 改良Osborne 法分級(jí)分離4 種蛋白

（1）清蛋白提取。稱取脫脂文冠果粕，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬螅?5 ℃下超聲提取，接著在40 ℃恒溫下攪拌60 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，離心后得到的沉淀用于下一步蛋白提取，上清液即清蛋白提取液。之后按照表1 所示方法處理，將上清液以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心15 min，收集沉淀，上清液于4 ℃下靜置一段時(shí)間后離心和抽濾，合并沉淀和濾渣，之后用冷凍干燥機(jī)凍干稱質(zhì)量。

（2） 球蛋白提取。?。?） 中第一次離心得到的沉淀物，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入10%NaCl 溶液，后續(xù)收集蛋白提取液的步驟與清蛋白提取方法相同，之后按照表1 所示方法處理，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心15 min，收集沉淀，上清液于4 ℃下靜置一段時(shí)間后上層出現(xiàn)未沉淀的蛋白，抽濾后將濾渣和上述沉淀合并，之后用冷凍干燥機(jī)凍干稱質(zhì)量。

（3） 醇溶蛋白提取。?。?） 中第一次離心得到的沉淀物，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入70%乙醇，后續(xù)提取蛋白的方法與清蛋白提取方法相同，得到的蛋白提取液采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在78.1 ℃下除去乙醇，得到蛋白濃縮溶液，之后再用冷凍干燥機(jī)凍干稱質(zhì)量。

（4） 谷蛋白提取。取（3） 中離心得到的沉淀物，按照料液比1∶20（g∶mL） 加入0.05 mol/L NaOH 溶液，后續(xù)收集蛋白提取液的步驟與清蛋白提取方法相同，之后按照表1 所示方法處理，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心15 min，收集沉淀，之后用冷凍干燥機(jī)凍干稱質(zhì)量。

4 種蛋白提取液的處理方法見(jiàn)表1。

表1 4 種蛋白提取液的處理方法

1.6 測(cè)定油粕粗蛋白含量與4 種蛋白提取率

（1） 粗蛋白含量。文冠果油粕蛋白含量測(cè)定按GB 5511—85 微量凱氏定氮法測(cè)定。

（2） Osborne 法分級(jí)分離4 種蛋白的提取率。采用電子天平對(duì)不同溶劑分級(jí)分離得到的4 種蛋白稱質(zhì)量，并分別計(jì)算提取率。

1.7 4 種蛋白的酶解及其酶解產(chǎn)物的分離

采用超濾的方法對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離。首先，將分離得到的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白分別用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，之后分別用5，10 kDa的超濾膜分離收集相對(duì)分子量為5～10 kDa 和＜5 kDa的蛋白水解產(chǎn)物，具體操作方式如下：

準(zhǔn)確稱取一定量的蛋白樣品溶于蒸餾水中，用0.1 mol/L 的NaOH 調(diào)整溶液pH 值到7.0，添加木瓜蛋白酶（[E]/[S]=1/2），在振搖培養(yǎng)器中55 ℃下反應(yīng)4 h 后，于100 ℃下滅酶3～5 min，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min，酶解產(chǎn)物過(guò)0.45 μm 的水系膜，之后分別用10，5 kDa 的超濾膜分離并收集相對(duì)分子量為5～10 kDa，＜5 kDa 的4 種蛋白的酶解產(chǎn)物，最后將收集到的酶解液進(jìn)行冷凍干燥處理并置于-20 ℃下保存，作為下一步各蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化能力測(cè)定的樣品。

1.8 XPHs 對(duì)自由基清除能力的測(cè)定

采用下述2 個(gè)指標(biāo)分別對(duì)4 種蛋白不同相對(duì)分子量的酶解產(chǎn)物和谷胱甘肽GSH（陽(yáng)性對(duì)照） 的抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，比較分析不同分子量的酶解產(chǎn)物的抗氧化性，并依據(jù)測(cè)定指標(biāo)篩選出抗氧化活性最強(qiáng)的蛋白酶解產(chǎn)物，進(jìn)一步通過(guò)凝膠層析分離純化。

（1） 對(duì)DPPH·的清除能力。樣品溶液配制，取1 mg/mL 的樣品溶于4 mL 溶液中，配制質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 的溶液。

樣品組：取2 mL 樣品溶液加入2 mL DPPH·溶液（0.1 mmol/L，溶于95%乙醇），混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度Ai；

空白組：2 mL 95%乙醇溶液，加入2 mL 去離子水，于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定其吸光度A0；

對(duì)照組：2 mL DPPH·溶液，加入2 mL 去離子水，在相同波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Aj。

DPPH 自由基清除率按以下公式計(jì)算：

谷胱甘肽清除DPPH 自由基能力的測(cè)定方法同上述測(cè)定XPHs 清除DPPH 自由基能力的方法一致。

（2） 對(duì)·OH 的清除能力。準(zhǔn)確稱取各樣品溶于一定量的蒸餾水中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液，采用羥基自由基測(cè)定試劑盒測(cè)定各樣品的抗氧化活性。谷胱甘肽清除羥基自由基能力的測(cè)定方法同上述測(cè)定XPHs 清除羥基自由基能力的方法一致。

1.9 Sephadex G-25 凝膠層析分離

將處理好的Sephadex G-25 裝成1.6 cm×80 cm的玻璃層析柱，用純凈水將谷蛋白酶解產(chǎn)物相對(duì)分子量＜5 kDa 的組分（XGLPH-Ⅱ） 配置成20 mg/mL的溶液，上樣量為5 mL，過(guò)0.22 μm 濾膜（水相），用純凈水以20 mL/h 的流速洗脫，同時(shí)用紫外檢測(cè)儀檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm 處的吸光值，以得出檢測(cè)組分中是否具有更小相對(duì)分子量的活性肽。

2 結(jié)果與分析

2.1 文冠果油粕粗蛋白含量

文冠果油粕是文冠果種仁制油產(chǎn)生的副產(chǎn)品，含豐富的蛋白質(zhì)。經(jīng)凱氏定氮法測(cè)得，文冠果油粕粗蛋白含量為37.45%。在預(yù)處理過(guò)程中先過(guò)80 目篩后脫脂，致使大量蛋白顆粒丟失，且脫脂只是在石油醚中浸泡，時(shí)間短且未進(jìn)行攪拌，導(dǎo)致脫脂不充分，部分蛋白仍與油脂結(jié)合，影響粗蛋白含量測(cè)定。

2.2 Osborne 法分級(jí)提取4 類蛋白

采用傳統(tǒng)Osborne 法分級(jí)提取文冠果油粕中的4 種蛋白，傳統(tǒng)工藝中僅僅采用油粕在溶劑中加熱并不斷攪拌促進(jìn)蛋白溶解的方式。

傳統(tǒng)Osborne 法分級(jí)分離蛋白的組成見(jiàn)表2。

表2 傳統(tǒng)Osborne 法分級(jí)分離蛋白的組成

其中，球蛋白的提取率最高，為44.83%；谷蛋白次之，提取率為44.94%；清蛋白和醇溶蛋白的提取率都較低，不足5%。

依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12]，對(duì)Osborne 分級(jí)提取蛋白的方法進(jìn)行了優(yōu)化。按照改良Osborne 法分級(jí)分離蛋白，分別用蒸餾水、10%NaCl、70%乙醇和0.05 mol/L NaOH 順序提取4 種蛋白組分，之后分別稱質(zhì)量，得到文冠果油粕蛋白分級(jí)分離組分的組成。與傳統(tǒng)Osborne 法不同，采用改良Osborne 法后，谷蛋白的提取率最高，為53.87%；球蛋白次之，其提取率為24.59%；醇溶蛋白清蛋白的提取率分別為17.65%和3.88%。

綜上所述，Osborne 法改良前后對(duì)4 種蛋白的提取率有很大的影響，因此對(duì)改良前后的蛋白總提取率和4 種蛋白提取率做了分析比較。

改良Osborne 法分級(jí)分離蛋白的組成見(jiàn)表3。

表3 改良Osborne 法分級(jí)分離蛋白的組成

Osborne 法分級(jí)分離蛋白的提取率見(jiàn)圖1。

由圖1 可知，總體來(lái)說(shuō)，采用改良Osborne 法后，清蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和球蛋白的提取率明顯提高，4 種蛋白的總提取率也顯著增大。其中，醇溶蛋白提取率顯著增大，從3.92%升至17.65%；4 種蛋白總提取率提高了52.67%。因此，通過(guò)優(yōu)化得到改良Osborne 法最佳工藝參數(shù)為料液比1∶20（g∶mL），超聲功率600 W，超聲溫度35 ℃，水浴時(shí)間30 min，閃時(shí)提取10 次，每次15 s，間隔5 s；之后再在恒溫40 ℃下磁力攪拌60 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min；離心后收集上清液按照表2所示方法處理后，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min 離心15 min，收集沉淀，上清液于4 ℃下靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行離心和抽濾，合并沉淀和濾渣，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，即可得到分類蛋白。

試驗(yàn)中，改良Osborne 法提取蛋白工藝優(yōu)勢(shì)在于采用了超聲波和閃時(shí)提取輔助提取蛋白的工藝，極大程度地提高了蛋白提取率。孫英等人[13]研究了超聲預(yù)處理對(duì)茶籽粕多肽抗氧化活性的影響，結(jié)果顯示以茶粕抗氧化肽的還原力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，超聲波處理后的與未處理的相比較，多肽對(duì)羥基自由基、超氧自由基的清除率和還原力吸光值的增長(zhǎng)率分別為79.33%，71.72%，113.8%。閃提過(guò)程中，機(jī)械剪切力作用產(chǎn)生大量新生表面，蛋白質(zhì)快速溶解和擴(kuò)散，提取率逐漸提高。李雅松等人[14]采用優(yōu)化后的閃時(shí)提取工藝提取栗葉蛋白，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，栗葉蛋白得率顯著增大，在2 min 內(nèi)蛋白提取率增大3%。綜上所述，試驗(yàn)中改良Osborne 法提取蛋白的工藝可顯著提高蛋白的提取率。

Osborne 法分級(jí)分類提取蛋白是試驗(yàn)關(guān)鍵的一步，為后期試驗(yàn)中對(duì)蛋白酶解產(chǎn)物多肽抗氧化活性的研究準(zhǔn)備出豐富的原料蛋白。對(duì)比相關(guān)文獻(xiàn)，試驗(yàn)在提取蛋白過(guò)程中也存在缺陷，可在以后的研究中進(jìn)一步工藝優(yōu)化。經(jīng)分析，可能導(dǎo)致以上試驗(yàn)結(jié)果的原因如下，油粕的預(yù)處理過(guò)程很重要，其脫脂和粉碎程度直接影響到蛋白顆粒在4 種溶劑種的溶解度，而在試驗(yàn)中，脫脂時(shí)間短、未攪拌，導(dǎo)致脫脂不充分，部分蛋白仍與油脂結(jié)合，影響蛋白溶解。

2.3 XPHs 對(duì)DPPH 自由基的清除能力

DPPH 自由基在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，在517 nm 處有一個(gè)特征吸收峰，自由基清除劑可與DPPH 自由基的孤對(duì)電子配對(duì)，使其在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度變小，顏色從紫色褪至黃色。因此，通過(guò)測(cè)定吸光度的變化可評(píng)價(jià)對(duì)DPPH 自由基的捕獲能力。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、實(shí)用且重現(xiàn)性好，多用于天然有機(jī)化合物和植物提取物的抗氧化活性評(píng)價(jià)[15]。

XPHs 對(duì)DPPH·的清除率見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，文冠果油粕蛋白酶解產(chǎn)物多肽具有抗氧化活性，清除DPPH 自由基的能力按從大到小 排 列 依 次 為XAPH-II＞XPPH-I＞XAPH-I＞XGPHII＞XGPH-I＞XPPH-II＞XGLPH-I＞XGLPH-II。谷 蛋 白和清蛋白的酶解產(chǎn)物中分子量＜5 kDa 的多肽抗氧化能力高于分子量5～10 kDa 的多肽抗氧化能力，而醇溶蛋白和球蛋白的分子量＜5 kDa 的酶解產(chǎn)物的抗氧化能力低于分子量5～10 kDa 的抗氧化能力；在同濃度條件下，分子量＜5 kDa 的清蛋白酶解產(chǎn)物多肽對(duì)DPPH 自由基的清除率最高，可達(dá)64.81%。醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白的酶解產(chǎn)物多肽對(duì)DPPH 自由基的清除能力相近，清除率在20%～40%，其中球蛋白酶解產(chǎn)物多肽分子量＜5 kDa 對(duì)DPPH 自由基的清除率最低，低于10%?；钚噪牡姆肿恿吭? kDa 以下，抗氧化能力與其分子量大小有密切關(guān)系，且一般含2～10 個(gè)氨基酸[16]。這與試驗(yàn)的結(jié)果一致，可以得出，以清除DPPH 自由基能力為指標(biāo)，文冠果油粕蛋白酶解產(chǎn)物多肽中分子量＜5 kDa 的清蛋白酶解產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性，而同濃度下相同分子量范圍的醇溶蛋白和球蛋白酶解產(chǎn)物多肽的抗氧化活性較弱。

谷胱甘肽是一種特殊的氨基酸衍生物，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物，分為還原型谷胱甘肽（GSH） 及氧化型谷胱甘肽（GSSH）兩類[17]。還原型谷胱甘肽具有保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗氧化、清除氧自由基、解毒等作用。試驗(yàn)以還原型谷胱甘肽為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)得在相同濃度下，GSH 對(duì)DPPH 自由基的清除率可達(dá)到93.5%，而上述試驗(yàn)中篩選得到的具有較強(qiáng)抗氧化性的分子量＜5 kDa 的清蛋白酶解產(chǎn)物多肽對(duì)DPPH 自由基的清除率與其接近。

2.4 XPHs 對(duì)羥基自由基的清除能力

羥基自由基是氧化性最強(qiáng)的自由基，可和大部分生物大分子發(fā)生不同類型的反應(yīng)，具有較高的速率常數(shù)，是危害最大的活性氧，因此研究清除·OH活性物質(zhì)具有很重要意義。試驗(yàn)采用Fenton 反應(yīng)體系來(lái)檢測(cè)文冠果油粕分類蛋白肽清除·OH 的效果，其原理是H2O2的量和Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基成正比，當(dāng)給予電子受體后，用griess 試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與·OH 的多少成正比關(guān)系[18]。

XPHs 對(duì)·OH 的清除率見(jiàn)圖3。

由圖3 可知，文冠果油粕分類蛋白酶解產(chǎn)物具有抗氧化活性，清除·OH 的能力按從大到小排列依次為XGLPH-II＞XGLPH-II＞XPPH-I＞XAPH-II＞XG PH-I＞XGPH-II＞XAPH-I＞XPPH-II。球蛋白和清蛋白的酶解產(chǎn)物多肽分子量＜5 kDa 的抗氧化能力高于分子量5～10 kDa 的抗氧化能力，而醇溶蛋白和谷蛋白的酶解產(chǎn)物多肽分子量＜5 kDa 的抗氧化能力低于分子量5～10 kDa 的抗氧化能力；在同濃度條件下，分子量小于5 kDa 的球蛋白酶解產(chǎn)物多肽對(duì)·OH 的清除率最高，可達(dá)75.00%。醇溶蛋白、谷蛋白、球蛋白的酶解產(chǎn)物多肽分子量＜5 kDa 對(duì)·OH 的清除能力相近，清除率為60%～65%。醇溶蛋白酶解產(chǎn)物多肽分子量＜5 kDa 和清蛋白酶解產(chǎn)物多肽分子量5～10 kDa 對(duì)·OH 的清除率最低，約為30%。綜上所述，就清除羥自由基能力這一評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)而言，文冠果油粕分類蛋白肽中分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解產(chǎn)物多肽具有較高的抗氧化活性。

試驗(yàn)以還原型谷胱甘肽GSH 為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)得在相同濃度下，GSH 對(duì)·OH 的清除率可達(dá)到90.0%，而上述試驗(yàn)中篩選得到的具有較強(qiáng)抗氧化性的分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解產(chǎn)物多肽對(duì)·OH 的清除率達(dá)到75%。

2.5 Sephadex G-25 凝膠層析分離

由上述試驗(yàn)得出，文冠果油粕蛋白酶解產(chǎn)物多肽中分子量＜5 kDa 的清蛋白多肽和球蛋白多肽都具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，其中清蛋白多肽清除DPPH 自由基的能力較強(qiáng)，而球蛋白多肽傾向于清除羥自由基，并且球蛋白多肽對(duì)2 種自由基的清除能力差異較大，鑒于此，為以后進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，試驗(yàn)則以清蛋白酶解產(chǎn)物多肽為對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行凝膠層析分離。

分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解產(chǎn)物的凝膠層析洗脫峰圖見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，XGLPH-II 經(jīng)Sephadex G-25 凝膠層析分離得到3 個(gè)組分，分別在250，600，750 min開(kāi)始出現(xiàn)明顯的吸收峰，試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明分子量＜5 kDa 的球蛋白酶解產(chǎn)物中存在分子量更小的肽段。張強(qiáng)[19]同樣采用Sephadex G-25 對(duì)堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉得到的產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到3 個(gè)洗脫峰，但只有第二峰有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以推斷，試驗(yàn)通過(guò)凝膠層析得到的這3 個(gè)峰中存在具有較強(qiáng)抗氧化活性的肽段。因此，要進(jìn)一步獲得有抗氧化活性的目標(biāo)肽段，需要進(jìn)一步通過(guò)液相色譜等方法分離純化，并通過(guò)抗氧化活性測(cè)定不斷篩選。

3 結(jié)論

研究文冠果油粕4 種蛋白的分離工藝及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。試驗(yàn)結(jié)果如下：文冠果油粕粗蛋白含量為37.45%，改良Osborne 法分級(jí)分離4 種蛋白，谷蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白提取率依次為53.87%，3.88%，17.65%，3.88%，上述4 種蛋白酶解產(chǎn)物中的活性肽的抗氧化性與蛋白種類和相對(duì)分子量有關(guān)。在同濃度條件下，就對(duì)DPPH 自由基的清除能力而言，清蛋白酶解產(chǎn)物中相對(duì)分子量＜5 kDa 的組分對(duì)DPPH·的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到64.81%，而球蛋白酶解產(chǎn)物相對(duì)分子量＜5 kDa 的組分對(duì)·OH 的清除能力最強(qiáng)，清除率可達(dá)75%。嚴(yán)群芳[20]分離得到的6 個(gè)大豆蛋白肽片段中，10 mg/mL SP4 對(duì)羥自由基的抑制率達(dá)80.13%，試驗(yàn)中1 mg/mL XGLPH-II 對(duì)·OH 的清除率達(dá)75%，但其所需濃度僅為上述大豆蛋白肽濃度的1/10；賈薇[21]測(cè)定質(zhì)量濃度為8 mg/mL 大米肽對(duì)DPPH·的清除率約為80%，試驗(yàn)分離得到的XAPH-II 在其質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率即可達(dá)64.81%。由此，文冠果油粕有望成為提取天然抗氧化肽的新一種植物資源。這將極大地?cái)U(kuò)大文冠果的開(kāi)發(fā)利用范圍，同時(shí)也為開(kāi)發(fā)新的生物抗氧化劑提供了新方向。